Bitki Doku Kültürü Çalışmaları
 

İyi günler,
Üniversitede öğrenci iken kütüphanede bulduğum bir kitapta (sonradan Sigma nın katoloğu olduğunu öğrendiğim :)) çeşitli kaplarda agar içerisinde üretilmiş yeşil bitkiler dikkatimi çekmişti ve o zamanlar araştırmama rağmen nasıl ne şekilde yapıldığını öğrenememiştim. Yıllar sonra yeterli donanımım ve imkanımım olması, içimde kalan bu isteğimi gerçekleştirmemi sağladı. :)
Bir süredir çeşitli bitkilerin in vitro ortamda üretimleri ile ilgili çalışmalar yapıyorum. Bu konuda yaptığım araştırmalarda türkçe kaynakların yeterli olmadığını gördüm. Aramızda bu konuyu merak edenlerin, araştıranların olduğunu biliyorum. Bu yüzden yaptığım çalışmaları sonuçları olumlu olsun olmasın fotoğraflayarak ve sizlerle paylaşmak istiyorum. Bu şekilde çalışan başka arkadaşlarında deneyimlerini görmeyi, tecrübelerinden yararlanmayı umuyorum.

Bütün çalışmalar biyogüvenlik II seviyesinde bir Laminair Flow Kabinde gerçekleştirildi. Bu kabin steril bir şekilde çalışmaya imkan veriyor. Ek olarak kullanılan ekipmanın alevden geçirilmesi için bir bek ateşi karşısında çalışıldı.

Bitkilerin üretilmesinde; Sigma firmasının çeşitli besi yerleri kullanıldı. Bunlar üzerlerinde belirtilen oranlarda hazırlanıp agar ilave edilerek (MS hariç) otoklavlandı. Kullanılacağı zaman mikrodalgada eritilerek kültür kaplarına porsiyonlandı.

Bu da ilk olumlu sayılabilecek denemelerimden birisi. Bir Rhipsalidopsis Gaertneri yaprağı küçük parçalara (12 parça) ayrılarak hazırlandı. Malesef hazırlanış aşamasıyla ilgili elimde foto yok çünkü sonucun olumlu olabileceğini düşünmemiştim. Kullandığım 24 gözlü pleytlerdeki lale soğanları kontamine olunca (küf ve mantar) bende agarı bir ay boyunca ışık kaynağı altında kurumaya terketmiştim. Pleyti atmak üzereyken yaprak parçasından küçücük bir çıkıntı çıktığını farkettim. Emin olmamakla birlikte alıp perlit karışımına diktim. Bu fotograf yaklaşık 2 ay sonra perlitten çıkarılarak çekildi. Toplam 3 ay, uzun bir süreç..Aslında bu türler zaten yapraktan kolay üreyebiliyorlar. Fakat burada bir yaprağın 12 parçaya bölündüğünü düşünürsek (daha da küçük bölünebilir) sonucun güzel olduğunu söyleyebiliriz, en azından benim için :) çok mutluyum, darısı diğer kültürlerimin başına..

Karanfil doku kültürü
 

Kesme karanfilden hazırlanan kültür çalışması. Öncelikle karanfil dalı %15 lik sodyum hipoklorid (Çamaşır suyu) ile 30 dakika dezenfekte edildi. Çift yapraklı göz bölgeleri steril bir şekilde kesilerek yapraklar kısaltıldı. Dikkatli bir şekilde steril tüplere alınarak ventilizasyon yapacak şekilde ışık kaynağı altında inkübe edildi.

Bir hafta boyunca hergün kontrol edilerek kontamine olan tüpler elimine edildi. İkinci fotografta küf kontaminasyonu oluşan bir tüp görülmekte.

1.foto: 1 haftalık sağlıklı kültür
2. foto: aynı kültürün 2 haftalık hali

Tüplere sığmayan kültürler agardan çıkarılarak daha geniş bir agarlı tüpe alındı. İlk fotografta bir haftalık olan karanfil kültürü ikinci fotoğrafta en önde görülmekte. Bir önceki mesajda gösterilen kültür ise en arkadaki. Ortadaki kültür dokusu tüpe girdikten sonra çiçek tomurcuğu çıkardı.
Son fotoda ise dün itibariyle üçünün de 15 lik tüplere geçilmiş halleri görülmektedir.
Kültürlerin akibetlerini daha sonraki mesajlarda göstermeyi ümit ediyorum.
Saygılarımla

ellerinize sağlık ne güzel yapmışsınız

Teşekkürler, bende kimsenin takip etmediğini düşünmeye başlamıştım :)

Olur mu hiç? Her gün bu konuyu tıklıyorum benn. Dün çekilen resim süper. İnşallah topraktaki hallerinide göreceğiz bu karanfillerin... :)

bu çalışmalarınızı özel olarak mı yapıyorsunuz

Elinize sağlık. Başarılar dilerim. Gelişmeleri takip etmek zevkli olacak.

Sayın Cansunarya,

şu sıralar böyle bir microbiolojik laboraruta ulaşım yetkim olmadığından artık evde tencere tava fırın ile kör topal bu çalışmaları yürütmeğe çalışıyoruz. Sizde bu imkanlar varken hatta gördüğüm sigma-aldrichin 6668 i bile varken neden karanfil v.s. gibi bitkilerle vakit kaybediyorsunuz, :D
tabii bu bir şaka...
Phal. gözlerinden bu tarz ekim yaptınız mı?

Sayın Cansuya , suni bir aydınlatma kullandınız mı ?
- kültürleri köklenmeleri için daha büyük bir kaba alınmalımı ? bu işlemde aynı besin yeri mi kullanılmalı mı?
- evde steril bir ortam hazırlanabilir mi ? ( bu işlem için )
- herkes bu besin yerini temin edebilir mi ? nereden edinilir ?
-karışımın hazırlanması ve sterilize edilip kültürkaplarına alınması hakkında daha geniş bilgi verebilir misiniz ?
- karanfil kültürü kök **** yaprak vermeden neden tomurcuk oluşturmaya çalışmış kullandığınız besinde eksik **** fazla birşey mi var ?

Merhaba
 

Bu çalışmaları baştada bahsettiğim gibi hobi amaçlı yapıyorum, işimden fırsat buldukça uğraşabiliyorum. Aslında bu konuda pekçok literatür taraması yaptım ama kendi literatürlerimi bile okuyacak zamanım olmuyor, bu yüzden işin çok derinine inemiyorum.
Sayın Erkan hocam, aslında sizin orkidelerle ilgili verdiğiniz bilgilerden sonra bu işe başlamaya karar verdim. İlk amacım zaten phal üretmekti, ama bildiğiniz gibi orkideler çok nazlı, biraz sabırsızlanarak diğer bitkilerin üretimine geçtim bende..Elimde 6-7 aydır jel içerisinde bekleyen, göz içermeyen, phal çiçek saplarım var henüz hiç bir aktivite yok ama yeşil yeşil öylece duruyorlar :) Esas nod kültürümü 3 hafta önce phallerim son çiçeklerini döktüklerinde yaptım. Şu anda yeşiller, kontaminasyon yok ve gün geçtikçe büyüyorlar..Bir sorun olmazsa akşama evden fotolarını yükleyeceğim.
Işık kaynağı olarak normal bir masa lambasına 80 wattlık bir ampül taktım, yaklaşık 20 saat boyunca yanıyor.
Burada kullandığım tüpler 1.8 ml lik olduğu için büyüyen sapları bir süre sonra başka kaplara almak zorunda kaldım aslında geniş olsaydı biraz daha orada kalabilirlerdi. Ben yine normal MS besi yeri kullandım ama biraz daha toparlandıklarında İBA ekleyerek kültüre edicem, çünkü bu halleriyle kök salmayacaklar sanırım.
Bitki kültürü için pekçok farklı besi yeri, katkı maddeleri vs. var yapılacak kültüre göre bunları seçmek önemli , ama ben denemek maksadıyla kabaca en temel olanlarından aldım. Aşağıdaki siteyi inceleyebilirsiniz bunun için. Tüm medikal firmalardan herkes temin edebilir.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/...lePage/9435343

Nodien kulturda yani nod ekiminizde kullandığınız besi yeri neydi?
mikrotom var mı lab.da? meristem düşünürmüsünüz. Galiba diğer bir bitkide onu denemişsiniz yanlış anlamadı isem.... :)

Besi yerlerinin üzerlerinde litreye kaç gr tartılması gerektiği belirtiliyor. İhtiyaç ölçüsünde steril bir cam kaba tartılıp distile su ile sulandırılıyor, eğer içeriğinde agar yoksa lt ye 6-7 gr kadar agar ilave ediliyor ve varsa diğer katkı maddeleri, PH 5.6 ya ayarlandıktan sonra 126 C lik otoklavda 15 dakika steril ediliyor. Ben 50 ml lik şişelerde otoklav ediyorum buzdolabında saklıyorum. Kullanacağım zaman mikrodalgada çözdürerek ihtiyacım kadarını steril bir ortamda yine steril ekipmanla tüplere geçiyorum.
Çiçekçilerdeki kesme çiçekleri görüp her zaman hayran kalmışımdır. Eğer onları köklendirmeyi başarabilirsem nekadar çiçekli bitki varsa hepsini denemek istiyorum :) Normalde insan ve hayvan dokularından kültür hazırlanması için ölümden 1-2 saat içinde dokuların işlenmesi gerekir ama gördümki bitkiler için durum böyle değil, çok rahat yaşayabiliyorlar. Karanfilde aldığım dokular aslında normalde tomurcuğun çıktığı bölgeler..Ben bu durumu bekliyordum. Kullandığım agarda köklendirici hormon yok, bu yüzden köklerde henüz çıkmadı. Baştan itibaren hormonlu yapabilirdim ama çıkabilecek kontaminasyonları elimine etmek için bekledim. bu hafta sonunda onları hormon içeren besi yerlerine alacağım.
Evde steril bir ortam tabiiki hazırlanabilir ama en ufak bir kontaminasyon çalışmalarınızı kaybetmenize sebep olabilir. Ben iki haftadır elimde olan gül kültürlerimde bugün muhtemel maya kolonisi oluştuğunu gördüm ve çok moralim bozuldu. Şimdiye kadar elimdekilerin yarısı kadar kontaminasyonlu tüp attım. Eğer gerçekten meraklıysanız hayallerinizin peşinden gitmenizi, yılmamanızı tavsiye ederim. Sonuç olarak ev ortamında da gerekli sterilizasyon yöntemleri uygulandıktan sonra neden yapılamasın? :) Ben böyle bir ortamım olmasaydı evde de kesinlikle denerdimm!

Hocam, bahsettiğiniz şey kesit almaya yarayan mikrotom mudur acaba yoksa mikroton başka bir şey midir? eğer mikrotomsa diğer lablarda var kullanabillirim ama nasıl steril edilir bıçaklarımı yoksa tüm cihazmı onu bilmiyorum. Yaptığım çalışmalar sanırım meristemi hedefliyor ama şimdilik nodları saplarıyla birlikte 2-3 cm lik parçalar halinde kültüre ediyorum. Bu meristem kültürü hakkında bilgi verebilirseniz sevinirim.
Nod kültürlerinde Lotte ve thomas ın yöntemini kullanıyorum köklenene kadar Sigma nın P6793 içinde kültüre edicem.
Saygılar

evet "n" ve "m" karışmış. bazen "a" ve "e" yi de karıştırdığım gibi.
Bir tür klavye legastenie si mi desem.... :)
Pardon. elbette microtom olacaktı...

Merhaba arkadaşlar bende bu konuya ilgi duyanlardanım ama çok acemiyim.Bu acemilikle evde doku kültürü denemesi yaptım ilk denememi dört kavanozla yaptım.Bitki parçaları yerine tohum kullandım bir hafta dolmak üzere kavanozlardan birinin içindeki tohumlardan birinin etrafı küf gibi bi oluşumla kaplandı diğer üç kavanozda hiçbi değişim yok.Diğer kavanozlardaki tohumların küflenmemesi mikrop kapmadıklarınımı gösterir yoksa daha bişey söylemek için erkenmi?

Benim tek tohum denemem kaküle tohumları üzerine oldu. Onlarda 7 aydır hala duruyorlar, atmaya kıyamadım belki bişeyler olur diye :) Ama ne kontaminasyon var ne de çimlenme..Dolayısıyle kontaminasyonun olmaması çimleneceği anlamınada gelmiyor, merak ettim acaba besi yeri olarak ne kullandınız?

Pardon, foto eklediğimi unutmuşum :) bunlar Gerbera ve Galla çiçeklerinin saplarından hazırladığım kültürler, hazıra kaçtım tek tek uğraşmak istemedim, bu yüzden 24 lü gözlerdeler. Ama farkettimki bu tür süngerimsi dokulu ve tüylü bitkiler yeterince çamaşır suyuna maruz kalamıyorlar, bende bundan sonrakilere yüzey geriliminin düşmesi ve sterilizasyonun tüm yüzeylerde etkili olması için bir damla Tween 20 (bir çeşit noniyonik deterjan) ilave ettim. Daha etkili oldu. Aşağıda çeşitli küf kontaminasyonları görülmekte..

Orkide nod kültürü
 

Burada yaklaşık üç hafta önce başladığım nod kültürlerini sizlere adım adım fotograflarla göstermek istiyorum. Şimdiye kadar çiçeklerine kıyamadığım için hepsinin geçmesini bekledim, kesilen yerler yan çiçek dallarıdır, ana dallar tekrar tomurcuklandığı için onlara dokunmadım.
Kesilecek dal alkolle silindikten sonra steril bir bistüri ile kesilir..

Nod içeren saplar tween 20 li %15 lik çamaşır suyu içeren steril distile su ile yarım saat steril edildi. Sonrasında steril distile su ile en az 3 kez yıkandı ve kesim için steril bir petriye alındı.

Nod kısımları steril bistüri ile uygun boyutlarda kesildildikten sonra gözleri örten bitki parçası dikkatli bir şekilde pensle kaldırılıyor ve alttaki uyuyan göz açığa çıkarılıyor. Yeni yavrumuz umarım bu gözlerden büyüyecek :)

Hazırlanan agar mikrodalgada eritilerek küçük tüplere 0,5-1 ml olacak şekilde porsiyonlanıyor ve uygun ısıya gelince orkide parçaları tüplere yerleştiriliyor, ağızları solunum yapacak şekilde gevşek olarak ışık kaynağı altında inkübe ediliyor.

Besi ortamı için inositol ve tiamin vitaminleri miracid(gübre sülüsyonu) şeker antibiyotik agar kullandım.

Sayın Cansunarya , ağızlarını gevşek bıraktığınız tüpleri nerede muhafaza edeceksiniz ?

Yazılı düşünüyorum... :D
Tween 20'nin penetrasyon gücü yani ıslatma gücü yetmemiş olabilir mi? Suyun yüzey gerilimi yeterince düşmemiş olabilir mi?
Ben Tween 80 kullanıyorum. Bir de aklıma bu iki özeliği bir arada olan hemen şu an aklıma gelen benzalkonyum-chlorit geldi. Hem tensid hemde çok iyi bir dezenfektan. Gerçi dokukültüründe kullandıklarını hiç duymadım deneyeniniz oldu mu?

Sayın cansunarya,
Benim gördüğüm çiçek sapının gonca uçlarını ve geçmiş gözleri de kültüre yatırmışsınız? Yanlış mı anladım, gördüm?
Son yıllarda bitki üzerinde iken bu gözlere keiki-boost ticari ismi olan bir mamul kullandım. İçeriği söylenmiyor. Ancak gözlerden keiki oluşumunu tetikler bir ürün. Bu ürün steril değil doku kültürü tatbikatında belki mikrodalga ile steril edilirse uygulama akla yatkın gibi geldi bana?

Görüyorum ki bu arada aramızda ne cevherler varmış da haberim yokmuş... :)
Miracid thiamin inositol... bare bu deneyimleri bizimle daha detaylı paylaşsanız. Bu gibi deneylerin hep müspet sonuçlanması gerekmiyor deneyin kötüye gitmesi bile bize bu yoldan olamıyacağı konusunda da çok fikir sahibi yapabiliyor.

Çok eğitici ve açıklayıcı bir çalışma olmuş/oluyor. Elinize sağlık cansunarya.

Cesaretlendirici destekleriniz için teşekkürler..
Sayın ephesos,
Tüpleri şu anda laboratuarımda tutuyorum, zaten steril bir ortam olduğu için sorun çıkmıyor. Ev ortamında da baktım onlara, eğer hava sirkülasyonu olmayan bir yere koyarsanızda pek sorun çıkmayacaktır. Yalnız mutfağa yakın olmasın malüm en fazla kontaminasyonun bulunabileceği alan.
Sayın warbanik, bende Erkan hocam gibi düşünüyorum, kültürlerin sonucu kötüde olsa durum hakkında fotolu bilgilerinizi paylaşırsanız diğer arkadaşlarda yararlanır, zira sizin uyguladığınız teknik ev ortamında daha kolaylıkla gerçekleştirilebilir.

zaten var olan aşkı alevlendirdiniz çok teşşekkür ediyorum çalışmalarınızı bizlerle paylaştığınız için

Erkan hocam,
Elimde tween80 ve Dezen ticari isimli benzalkonyum-chlorit de var, toksik olabileceğini düşünerek 20 ile başlamıştım, dezenfektan kullanmak hiç aklıma gelmemişti. El ve cilt dezenfeksiyonunda kullanıldığına göre sanırım sorun yaratmayabilir. İlk çalışmamda bu ikisinide deneyeceğim, çok teşekkürler.. Siz hiç denemediniz galiba değil mi? Hocam sizin çalışmalarınızı görmek mümkün olurmu acaba burada
Bu arada ilk denemelerim hidrojen peroksitin değişik derişimlerini kullanarak yaptım, pek başarılı olmadığını gördüm, sanırım bu şekilde dezenfeksiyonla hiç uğraşmamak gerek..
:) okuduğum bir makalede çiçek saplarının genel olarak kullanılabildiği yazıyordu, bende yine parçalara kıymamak adına goncaları bile kültüre aldım. Aslında pek birşey çıkacağını ümit etmiyorum ama bakalım ne olacak:)
Keiki-boost u internette araştırdım gerçekten güzel bir ürüne benziyor, sanırım jelimsi bir kıvamda değilmi, eğer sıvı olsaydı enjektör filtrelerden geçirilerek steril edilebilirdi. Veya sulandırmak mümkün olursa yine böyle kullanılabilir, mikrodalga tam olarak steril etmiyor malesef. Belki yapısı otoklav edilmeye uygundur. Ben daha önceden kullanılmış plastik kapları mikrodalgada steril etmeyi denedim ama hepsindede kontaminasyon oluştu. Sadece önceden steril edilmiş agarı eritmek için kullanılabilir. Keiki-boost u nasıl temin edebilirim acaba, denemek isterim gerçekten..

orkide nod kültürü pasaj
 

Bunlar kontaminasyonsuz 10 günü geride bırakan orkide nod kültürleri..kültürler kesilen kısımlarda fenolik maddeler salgılamaya başlıyor ve bu kısımlar siyahlaşıyor. Bu hale gelen kültürlerinin bir an önce yeni agara geçilmesi gerekiyor yoksa bu kısımlardaki dokular ölebiliyor.
1. ve 2. fotoda yan çiçek sapından alınan kesitte kapçığı kaldırılmamış gözün agar ortamında büyüyerek bu kapçığı kaldırması görünüyor. Ayrıca dip kısımda agardaki kararmalar fenolik eksudasyonu gösteriyor
3. fotoda bu şekildeki kültürlerin agardan çıkarılarak yeni agar kabı için hazırlanışı var
4. fotoda büyüyen gözler görülmekte, umarım keiki çıkar, çiçek sapı çıkaracağından korkuyorum
5. de fenolik eksudasyonlu agar içeren atık tüpler

Sterilizasyon için hidrojenperoksit kullanabilirmisiniz? Bir çok alanda çamaşır suyunun yerini almış durumda.

Pasajın son aşamasında orkide nod kültürleri yine steril bir ekipmanla yeni agarlı ortama geçilir (1. foto) vee beklemeye devam edilir.. Kültürleri evde tuttuğum zamanlar gece 4 te bile kalkıp acaba bir gelişme varmı diye bakıyordum :)
2. ve 3. fotolar; farklı fenolik eksudasyon görüntüleri, ortadaki artık gözden çıkarılmış, uçları fenolik eksudasyondan zarar görmüş orkide sap doku kültürü

Sayın Sergüzen, 34 nolu mesajda da belirttiğim gibi bu şekilde steril ettiğim kültürlerde pek randıman alamadım, üstelik taze dokuyu aşırı derecede tahribata uğratıyor, bitki gözlerinde bence tehlikeli, çoğunlukla hidrojen peroksitin kullanıldığını biliyorum ama ben çamaşır suyunu daha etkili ve güvenli buldum

Bildiğiniz gibi hidrojenperoksit yüksek konsantrasyonlarda deriyi tahriş ediyor, fakat düşük konsantrasyonlarda burun içine kanamayı durdurmak için tampon olarak tatbik edilebiliyor. Yani tahriş etmiyor. Bugün tıpta desenfektan olarak geniş bir alanda kullanılıyor. Bitkilerde neden olmasın? Acaba doğru konsantrasyonu mu yakalayamadınız. Bu konuda birşeyler bulursam size aktaracağım.

Aşağıdaki sitede tavsiye edilen derişimleri kullandım, farklı derişimler ve sürelerde denedim. Tabiiki kullanılabilir ama ben kendi adıma sodyum hipokloritten memnunum, daha çok farklı sterilizasyon yöntemleri var bu webde bulabilirsiniz ama denediğim ve çalışan bir yöntem varken başa dönmeyi düşünmüyorum, kontaminasyonlar tween 20 eklenmesiyle ortadan kalktı bundan sonra merak ettiğimden dolayı tween 80 ve dezenide deneyeceğim