http://www.orchideenvermehrung.at/cg...regulators.htm
node culture , download ve hints bölümünde bulabilirsiniz

Oberflächensterilisation
Zur Sterilisation der Sprosssegmente wurde Quecksilberchlorid (HgCl2) 0,1%ig, Tween 20 und dreimal Aqua dest. verwendet (nach PIERIK, 1987; GEORGE & SHERRINGTON, 1984).

Bu yazı bir tezden aktarıldı. Avustralya akasyalarının üretim teknikleri ile ilgili. Yukarıda kısaca, sterilizasyonda civaklorür ve Tween 20 kullanılmiş ve üç defa da destile su .

Sayın Cansunarya , çok bilmişlik yapmak istemem ama agara eğer köklendirici hormon eklemediyseniz kaiki yerine çiçek sapı çıkaracaklar gibi.

:) Rica ederim Ephesos, Orkideler için kullandığım medium büyüme hormonu katkılı onlarda bir sorun olmayacak inşallah, sadece karanfil ve diğer bitkiler için kullandığım MS besi yerinde hormonlar yok( basal medium), bugün onlara agar değiştirdim artık kökleneceklerini umuyorum..

İnternette; Sayın Buket Örücü nün hazırlamış olduğu 'Asmada Embriyo Kültürü' isimli teze ait sunu görüntülerini buldum, aynı sununun pdf formatıda var. Güzel bir çalışma olmuş, geniş bir bilgide var. İlgilenen arkadaşlar aşağıdaki siteyi ziyaret edebilir.
emyo.sdu.edu.tr/link/Sontez.ppt

Sayın Cansunarya,

Eski kayıtlarımı tekrardan gözden geçirdim, ancak bir yanlışlık olmuş ben Tween 60 kullanmışım. :( Aklımda 80 kalmış... ( yani Polysorbat 60 olacak)
Ben artık laboraturda çalışmıyalı uzun zaman oldu. Geçmişteki deneylerimin resmedemedim. Zaten fotoğraf makinelerinin lab.a girişi de yasaktı. (özel bir ilaç şirketi olunca.. :)) kaldı ki o zamanlar cep telefonları fotoğraf makineli dahi değillerdi adeta el bombası büyüklüğünde 6 saate pili biten türdendi. Microbioloji labı olan arkadaşlara da bu şekilde bir rica ile zahmet vermek istemedim. Laminairflowu olmıyan bir kabinde çalışmak da bu zamana kadar ilkel geldi bana. Kısacası bir kaç yıldır bu tarz ekimlerden uzak kaldım.
Ancak yeniden burda eski tanıdık alet edevatları görünce eski aşkım kabardı. sigmadaki kaydımı açtırdım sipleri verdim görecez bakalım ev şartlarında "taka-tuka" ne kadar başarılı olacağız. Bazı rahatlıklar olmayınca alşkın eller dahi bir birine dolanabiliyor... :(

Hocam tween 60 da bulabilirim sanırım. Bu arada mikrotomu soruşturdum, bıcakları steril edilebilir, kabinede koyabilirim cihazı, fakat; normalde parafilm blok tutucunun 2 cm lik genişliği varmış.. dokuyu nasıl buraya tutturmak gerektiğini bilmiyorum, birşekilde oturmasını sağlamak gerekiyormuş.
Çalışmalara başlamanıza sizin adınıza hem sevindim hemde heyecanlandım, kimbilir o güzelim hibrid orkidelerinizden neler elde edeceksiniz, bu tür çalışmaları ben bisiklete binmeye benzetiyorum, hocam deneyimli bir eller asla unutmaz, mukadderatları vardır :) ben başarılı olacağınıza ve çalışmalarınızı burada göreceğimize şimdiden inanıyorum..
Saygılarımla

Orkide nod kültürü 2. pasajı
 

1. pasaj sonrası yaklaşık bir hafta geçti, nod kültürlerinin agarını yine fenolik eksudasyondan dolayı yeniledim, bu arada bebeklerim oldukça büyüdü :) Şu anda 9 taneler.. eğer bir hafta içinde kök çıkarırsa kaorcal aktiviteli agara geçmeyi düşünüyorum.

Hocam kontiminasyona dikkat nasılsa elinizin altında bir laminair flow var ;) , yapraklanmadan köklenirseler bir mutasyon oluşurdu sanırım :D .
Başarılarınızın devamını dilerim hocam , takipteyim.

Shunshine blue'mu çoğaltma konusunda nasıl bu başlığı kıskanarak izlediğimi bilemezsiniz :)

Selahattin hocam, umarım sizde en kısa zamanda likapalarınızı çoğaltırsınız, acaba Türkiye de bu konuyla ilgilenecek, yardımcı olacak doku kültürü labı varmı?
Sayın Ephesos, Kalanchoe yaprak parçalarından hazırladığım bir kültür bu aralar kök uzantısı vermekte, (foto pek net değil ama ilerleyen günlerde tekrarlarım) yani kültürün yaprak çıkarmasına gerek yok, hmm belkide kültürün kendisinin yaprak olmasından dolayı kök çıkarıyordur nedersiniz :)

Aynen öyle hocam phelenaopsis gözlerinin önce yapraklanması gerek çünki kararsız gözü yapraklanarak kaikiye zorluyoruz , yaprak kültürlerde eğer kökten önce tekrar yaprak vermeleri işimize gelmez yani hocam bu kök yaprak olayı kültürümüzün niteliğine bağlı.
Maşallah , hocam sizde birşey bırakmamışsınız elinize negeçerse hop tüpe.:D

Var ancak 100 binlerle likapa siparişi alınca hem başka likapanın yüzüne bakmıyorlar hemde doku kültürü ilede olsa çoğlatılmasının zorluğundan kabul etmek istemiyorlar. Ancak çalışmalarım devam ediyor, edecek.

:) Çiçekli ne kadar bitki varsa hepsinin kültürünü yapmak istediğimi söylemiştim,azimle devam ediyorum, gözüm çiçekçilerdeki diğer bitkilerde, başarılı olursam protoplast hücre kültürüne geçmeyi istiyorum. Bu arada çalışmaların videolarını da çekebilirim ama forma eklenebiliyormu, youtube da kapandı?

http://www.ktunnel.com/ üzerinden youtubeyi açabilirsiniz. Aşağıda açmak istediğiniz link için adres bulunuyor gerçi o yotube yazılı olacak orda sadece "begin browsing" tıklamanız yeterli **** açılmayan başka site varsa adresi yazıp giriş yapabilirsiniz ktunnel üzerinden istediğiniz site açılacaktır.

Çok teşekkürler, en kısa zamanda güzel videolar koymayı düşünüyorum :). Türkiye den konu ile ilgili bir görüntüde buldum.
http://www.ktunnel.com/index.php/101...fd41b27f16782#

Sayın Cansunarya hocam , phelenaopsis nod kültürü için hangi besiyerini tavsiye edersiniz
(MS ,B5 ,LS )? **** bunların , hangisinin netür bir modifikasyonunu ?
Başarılı olduğunuz besiyeri **** uygun modifikasyonun konsantrasyonunu bizimle paylaşır mısınız ?
Teşekkürler.

İyi günler, bir süredir Afyon daydım, bugün geldim..
Sayın Ephesos, Orkide kültürü için geliştirilmiş farklı markalarda besi yerleri var, bunlar literatüre ilk kim eklemişse o isimle anılıyor, aynı ürünü farklı firmalarda farklı isimlerle bulabilmek mümkün. Sigma benim kendi alanımdada kulladığım, güvendiğim bir marka, bu yüzden bunu tercih ettim.
Sigmanın Phytamax tescilli orkide besi yerleri var (3.) katoloğa baktığımda MS besi yerlerini tamamen ayrı alana aldıklarını gördüm. Sanırım benim kullandıklarım MS den farklı, Knudson C nin besi yerinden modifiye edilmiş, ama geniş bir şekilde araştıramadım, emin değilim, belki hocalarımız daha iyi bilirler.
Aşağıda kullandığım iki besi yerinin bileşimleri var. Ben henüz ilk denemelerim olduğu için bunlar üzerinde hiç modifikasyon yapmadım. Pdf lerin 2. sayfasında hangi oranlarda nasıl hazırlandığı bildirilmiş. Anlayacağınız gibi ekstra birşey yapmayıp tamamen hazıra kaçıyorum, Türk usulü :)
Phytamaxlar arasında muz veya hindistan cevizi ekstraktlı olanları var, aslında çoğu literatürlerde oldukça başırılı olan besi yerleri bunlar. İleride onlardanda alıp deneme yapmak istiyorum. Size daha önceki mesajlarda web adresini verdiğim Lotte ve Thomas yöntemini tavsiye ederim, eğer prosedürde veya çeviride sıkıntınız olursa da yardımcı olabilirim.


http://www.sigmaaldrich.com/sigma/da...t/p6793dat.pdf
http://www.sigmaaldrich.com/sigma/da...t/p6668dat.pdf
http://www.sigmaaldrich.com/sigma/ge...id%20media.pdf

Orkide nod kültürleri 3. pasajı
 

Geçen hafta çarşamba çekilmiş pasaj fotolarını yeni yayınlayabiliyorum. Tüplerde fenolik eksudasyonun yanısıra opaklaşmada mevcut. İki kültürden biri iki küçük yaprağa sahip, diğeride henüz yaprak çıkarıyor. Bİr kültürde de (4.) çiçek sapına dönüşecekmiş gibi bir görüntü var.

Bu aşamada toplam 9 nod kültürünün pasajı yapıldı. Kültürleri yine steril bir ortamda çıkardıktan sonra 7 tanesini henüz yaprak gelişimi olmadığı için tekrar P6793 besi yerine aldım. 2 taneside (biri iki yapraklı) kök gelişimi için P6668 aktif kömür içeren besi yerine geçtim. Ne kadar heyecanlandığımı anlatamam, çook mutluyum :) Pasaj aşamasının küçük bir videosunuda çektim, you tube a eklemeye çalışıyorum

Süperler :) Çalışmaların sonuçlarını iple çekiyorum...

Sayın cansunarya,
bu kadar phenolic exudation normal göremiyorum. belki ben yanlışım.
Ama ben kendi adıma bunları bu sıklıkta yaşamadım diye hatırlıyor gibiyim. sebebi ne olabilir ... düşünüyorum....

Evet, banada pek normal görünmüyor, özellikle jelin şeffaf yapısını kaybedip bulanıklaşması pek hoşuma gitmedi ama kontaminasyon gibi de değil sanki. (Bu arada konuya yabancı arkadaşlar için belirteyim; mavi kapaklı cam şişedeki siyah agar; agar kömür içerikli olduğu içindir. Bir önceki mesajda plastik tüplerdeki siyahlaşma ise fenolik eksudasyon)
Bu konuda aşağıdaki web sitesinde demir eksikliğinden kaynaklanabileceği belirtilmiş ama oranlara baktığımda demir sülfat normal sınırda görünüyor.
Hem kültür öncesi hemde kültür sırasında Askorbik asit ilavesi tavsiye edilmiş, birsonraki sefere bunu deneyebilirim.
Bu web sayfasında Epheesos unda dikkatini çekebilecek farklı orkide medium bileşenleri var. Güzel bir site..
http://www.beffo.se/marax/index.php?...d=14&Itemid=26

Hocam şimdi aklıma geldi; kullandığım nodlar koyu pembe bir phale ait, ilk kültüre aldığımda kestiğim yerlerden jele pembemsi-eflatun bir renk yayıldı, giderek yoğunlaşarak siyahlaştı..Aşağıyada ekliyorum fotoyu biraz belli belirsiz ama hemen kesim hattında.. Acaba orkidenin renk bileşimi fenolik eksudasyon olarak bize gerimi dönüyor, :) bende yüksek sesle düşündüm şimdi..

Olabilir. Pembeye giden renklerin çiçek sapları ve yaprakları da o derece bir koyu pembelik hakim olur, ancak bunun özsuyuna geçip agarı da boyaması düşündürücü. desenfektasyondan sonra yeterince yıkamıyormusunuz acaba. ben nod'larda hala chlorlu bir desenfektasyondan taraf değilim. Hydrogenperoxit % 3,0'lük 3-5 dk bekletilemsi sonra değişik üç kapta steril destile suda yine en az bu sürelerde bekletmek kaydı ile yıkamak uygun olur kanısındayım.

Şayet hypochlorit ile dezenfecte ederseniz de sonradan steril kabinde steril şartlarda bir 3-5 mm kadar daha sap almanız gerekir. Bunun için de nod,ları baştan uzun tutun.
Besi yerine ektikten sonraki çevre şartlarınız nedir? ısı ışık gibi?
Bir de kaplarınız Phal. gözlerinden nod kültürü için fazlaca ufak olduğunu düşünüyorum. Gaz alışverişini sağlıyan bir düzenek var mı kapakta? Bazı resimlerde jelin kuruduğu da görülüyor.
Doğru mu?

Sayın Cansunarya hocam tavsiyeleriniz için çok teşekkürler.
Acaba kültüre alacağımız çiçek sapını göz göz ayırmadan steril etsek daha sonra steril ortamda ayırsak , böylece hpokloritin özsuyuna karışma ihtimalini azaltmaz mıyız ?
Böyle yapmamızın sakıncası varsa nedir ?

Hazır besi aldık diyelim, bu besi yeri nasıl hazırlanıyor tarif edermisiniz?

Nodun bulunduğu sapları yaklaşık 10-12 cm civarında kesiyorum. Tamamını 50 cc lik bir tüpe koyup 20-30 dk kadar hipoklorit solusyonunda beklettikten sonra tüm olarak 4 kez steril distile su ile yıkıyorum. Parçaları 10-12 cm lik petrilere alarak orada küçük parçalar halinde keserek tüplere öyle geçiyorum. Bu fotoların devamını 25,26,27. mesajlarda eklemiştim. Dolayısıyla kesit yüzleri ekstra bir yıkama yapılmadan agara geçiliyor ve sanırım buradaki parçalanan dokulardan bu eksudat çıkıyor. Yoksa hipokloritli doku iyice beyazlaşıyor buralardan da yaklaşık 1 cm kadar doku uzaklaştırıp, atıyorum.
Işık için 80 watt lık bir masa lambası kullanıyorum. 20/4 saat açık kalıyor. Normalde şimdiye kadar 20+-4 derecede duruyorlardı ama havalar ısındığı için bu aralar laboratuarda ısı biraz yüksek. Kendilerini toparladıklarında evimde onlara daha uygun bir ısı sağlayabilirim, malum Kayseri, kuzey cepheler serin oluyor :)
Nodları koyduğum tüpler gerçekten küçük, 1,8-2 cc lik tüpler, bazı nodları agara gömmemek adına 0,5 cc lik besi yeri ile kültüre etmek zorunda kaldım. Aslında şimdiye kadar yaklaşık bir hafta arayla agar değişimi yaptım ama tüpte bukadar az besi yeri varken son günlere doğru agar biraz kuruyor. Kullandıklarım vidalı cryotüpler, vidalı olunca çok hafif gevşek bırakıyorum ağzını, ventilizasyonlu büyük flasklarım var onlarıda iyice yapraklanınca kullanmayı düşünüyorum.

Selahattin hocam, besi yerlerini 50 cc lik hazırlıyorum.
Örneğin P6793 besi yerinin üzerinde litreye 25.3 gr hazırlanmalı diye yazıyor, Otoklavlanabilir bir şişeye 1.265 gr tartıp 50 cc den az (yaklaşık 40 cc) distile su ilave ediliyor.
Bunlar agar içermediği için 6-7 gr /lt (0,35 gr) agaroz kattım (bu aşamada mediumda yoksa sukroz, BA, IBA veya NAA eklenebilir, bu mediumda hepsi vardı)
pH NaOH veya HCL ile 5.6 ayarlanıyor.
Üzeri 50 cc ye tamamlanarak 121 C de 15 dk otoklav ediliyor
Buzdolabında saklayıp kullanımdan önce mikrodalga ile eritiyorum. Bu prosedürü 58 nolu mesajdaki linkte daha ayrıntılı bulabilirsiniz.

Bugün son 5 gündür görmediğim kültürlerimi kontrole gittiğimde çok heyecanlandım. Kontamine oldularmı, büyüdülermi, köklendilermi acaba derken bana süpriz yaptılar, 9 kültürün 6 sında ikinci bir yaprak (yeni filiz) gelişimi vardı :) yani bir noddan iki keiki alabilicem inşallah. İki yapraklı olan yavrumda 4 yapraklı oluvermiş :) Fotolarda nod filizlerinin yanlarından çıkan yeni filizler görebilirsiniz, ama henüz kök gelişimi yok..

Tebrikler hocam yolun sonuna geldiniz nihayet bence güneşe alın sıra köklerde 1 haftaya görürsünüz.

Sayın hocam P6793 besi yeri içerisinde pepton varken neden agaroz katma ihtiyacı duydunuz , aynı olayı tomas & lotte nin sitesindede gördüm nedenini açıklarmısınız hocam , teşekkürler.

Teşekkürler Ephesos, havalar bu aralar çok düzensiz gittiği için köklenene kadar yine ışık kaynağı altında tutmayı düşünüyorum, henüz kök yok ama giderek büyüyorlar :) Sizin kültür konusunda hazırlıklarınız varmı, ne zaman başlamayı düşünüyorsunuz?

Pepton bitkilerin ve pekçok mikroorganizmanın üretiminde besi kaynağı (Proteinlerin parçalanmış hali, amino asit kaynağı) olarak kullanılıyor, jel özelliği bulunmuyor. Agaroz ise sadece besi yerini jelatinöz hale getirmeye yarıyor, herhangi besleyici bir özelliği yok. İlk kullandığımda içerisinde agar olmadığına dikkat etmemiştim :) , otoklav sonrası besi yeri sıvı halde kaldı tabii bu şekilde kullanımıda oldukça zor.

Bu arada video görüntülerini ekleyemiyorum. Youtube a üye oldum ama üyeliği bir türlü onaylamıyor, web sayfasına da bağlanmıyor. Acaba bu videoları nereye ekleyebilirim bilen varmı...

Teşekkürler hocam , oysaki ben peptonların agar gibi katılaştırıcı bir özelliğinin olabileceğini düşünmüştüm.
Şu an araştırma safhasındayım çeviriler falan var onlarla uğraşıyorum temin ettiğim Türkçe kaynakları inceliyorum .
Çocukluğumun hayelleri depreşti biyolojiyi çok seviyordum hala ilkgünki gibide seviyorum bu konuda öğrenmeye doymuyorum sevdiği işi yapmak kadar insanı mutlandıracak başka birşey yok hocam.

Rica ederim..Haklısınız insan hayallerini gerçekleştirebildiği ölçüde mutlu oluyor. Çevremdeki insanlar 'senin işin gücün yokmu bunlarla uğraşıyorsun' gibi şeyler söyleselerde ben çok mutluyum onlarada aldırmıyorum..ve bunu anlayacak sizler gibi insanlarla paylaşmaktan daha da büyük mutluluk duyuyorum :) ..

Bu aralar kaktüs hücre kültürüne odaklandım, aşağıdaki webde aşamalarıyla verilmiş ve yaklaşık bir ayda yavru kaktüsler elde edilmiş..ama kullanılan besi yeri hakkında bilgi yok...

http://www.shroomery.org/forums/show...b/9/fpart/all/

Orkide goncasından bir süpriz :)
 

Hatırlarsanız orkide nod kültürü yaparken gonca uçları, geçmiş gözler ve köklerdende parçalar hazırlamıştım. Ama pek umut görmediğimden pasajlarını bile yapmadan ilk agarlarında öylesine tutuyordum. Öyleki fenolik eksudattan simsiyah oldu agarlar. Geçen gün bu goncalardan bir tanesinin yeşillenip geliştiğini farkettim, yanındaki kuru gibi görünüyor ama ondada kıpırdanmalar var. Hemen agar değiştirdim. Bakalım neolacak, sanırım meristem doku burada bol bulunduğundan olsa gerek..

Ummadığın taş baş yararmış hocam .

:) Evet, öyle gerçekten..Umarım keiki çıkarır..

Aşağıdaki linkte doku kültürü hakkında kullanışlı bilgiler var

http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_...Protocols.html

Sayın hocam agarla agaroz arasında ne fark var hocam , bildiğim kadarı ile agaroz elektrophoresis işlemi için kullanılıyor normal agar ın agaroza göre eksi bir yanımı var **** agarozun agardan dahafazla biryanı mı var ? birde hocam besi yerinin hazırlamasında verdiğiniz formülde litreye %6-7 gr /lt (0,35 gr) demişsiniz hocam bunu biraz açarmısınız ?

Agaroza genel kullanımda agarda denilmektedir, aslında kısmen ayrı şeylerdir. Agar deniz yosunundan elde edilmiş bir maddedir, genelde sarımsı, kötü kokulu (bence), hafif granülümsü olurlar. Otoklav edildiğindede sarımsı-jelatinöz bir yapı oluşturur. Pekçok mikroorganizmanın üretiminde temel besi yeri olarak kullanılır, bu yüzden kısa zamanda bakteri, mantar, küf vs. üretebilir. Agaroz ise agardan ekstrakte edilen bir polisakkarittir, beyaz, kokusuz toz şeklindedir. Kolayca kontamine olmaz. Dediğiniz gibi elektroforez, PCR v.b moleküler tekniklerde kullanılır.
:) çok dikkatlisiniz, düzeltme yaparken gözümden kaçmış :) hemen düzeltiyorum, doğrusu 6-7gr/lt olacak.. Teşekkürler :)