Bitki Doku Kültürü Çalışmaları

[praecox]

Sayın Cansunarya,

Dünki özel telefon görüşmemizde de değindiğiniz centrıfüj ile sterilizasyon konusunda bende burada bildiklerimi paylaşıp bu konuda bildiklerimi paylaşayım.

Telefondan da belirtiğiniz gibi belli bir devir ile bakterilerin hücre çeperlerini parçalamak sureti ile imha etmek mümkün.
Benim üniversitedeki araştırmalarımın birinde karaciğerin bazı enzimlerini elde etmemiz gerekmekteydi. mikrosol ve cytochrom p 450 gibi. bunun için belli bir aşamada hücreleri kaba bir parçalamadan sonra ince bir parçalama için centrıfüjde çok hassas belli bir devirde bazı hücreleri de praçlayıp bu enzimleri açığa çıkarymamız ve ayrıştırmamız gerekiyordu.
Buradan türetme ile bacterileri de bu şekilde parçalayıp yok edebiliriz. Ancak küf ve maya sporları bu müdahaleden zarar almadan kurtulabilir. Bir de bu esnada unutmıyalım ki orkide tohumları da ki bu sıvının içindeler ama bakterilerden daha sert bir yapıya sahip olduklarında dayanabilirler.

Kısacası fazla derine dalmadan devrini ayarlamak gerekir ve de bu şekilde uygun bir devirde daha steril tohumlar elde etme imkanımız olur. Bu konuda elimde maalesef ki bir araştırma yok.
Malumunuz üzre kimya ve biokimya veya diğer bilimler de de theori ve pratik çok iki değişik kavramdır ve theorinin deneylerle kanıtlanması tekrarlanabilirliğinin de desteklenmesi gerek.
Theori güzel bunu explizit olarak denemelerle destekliyebilirsik bu çok daha güzel.

Saygılarımla

[Cansunarya]

Orijinal Mesaj Sahibi praecox

Sayın Cansunarya,

Dünki özel telefon görüşmemizde de değindiğiniz centrıfüj ile sterilizasyon konusunda bende burada bildiklerimi paylaşıp bu konuda bildiklerimi paylaşayım.

Telefondan da belirtiğiniz gibi belli bir devir ile bakterilerin hücre çeperlerini parçalamak sureti ile imha etmek mümkün.
Benim üniversitedeki araştırmalarımın birinde karaciğerin bazı enzimlerini elde etmemiz gerekmekteydi. mikrosol ve cytochrom p 450 gibi. bunun için belli bir aşamada hücreleri kaba bir parçalamadan sonra ince bir parçalama için centrıfüjde çok hassas belli bir devirde bazı hücreleri de praçlayıp bu enzimleri açığa çıkarymamız ve ayrıştırmamız gerekiyordu.
Buradan türetme ile bacterileri de bu şekilde parçalayıp yok edebiliriz. Ancak küf ve maya sporları bu müdahaleden zarar almadan kurtulabilir. Bir de bu esnada unutmıyalım ki orkide tohumları da ki bu sıvının içindeler ama bakterilerden daha sert bir yapıya sahip olduklarında dayanabilirler.

Kısacası fazla derine dalmadan devrini ayarlamak gerekir ve de bu şekilde uygun bir devirde daha steril tohumlar elde etme imkanımız olur. Bu konuda elimde maalesef ki bir araştırma yok.
Malumunuz üzre kimya ve biokimya veya diğer bilimler de de theori ve pratik çok iki değişik kavramdır ve theorinin deneylerle kanıtlanması tekrarlanabilirliğinin de desteklenmesi gerek.
Theori güzel bunu explizit olarak denemelerle destekliyebilirsik bu çok daha güzel.

Saygılarımla

Hocam,

Phal tohumları için tekrardan çok teşekkür ederim. En kısa zamanda sizlerle burada tohum gelişmelerini paylaşmak için sabırsızlanıyorum .

Bazen çalışmalarımda kontamine olduğunu bildiğim dışkı gibi materyalleri yüksek devirli santrifüj işleminine tabii tutuyorum. 15.000 devirde 1 dk tuttup hücrelere ektiğim numunelerin hiçbirinde kontaminasyon şekillenmiyor. Benide küf ve maya sporları düşündürüyordu (ki dışkıda çok bulunurlar), ama şimdiye kadar onlarında geliştiğini görmedim, etkileniyorlar galiba..

Sizinle konuştuktan sonra tohumların santrifüje dayanıp dayanamıyacaklarını anlamak için küçük bir deneme yaptım.

Tohumları mikroskopta inceledikten sonra küçük bir miktarını sulandırarak 15.000 rpm de önce 1 dk santrifüj ettim. 1. dk dan sonra mikroskopta baktığımda hemen hemen hiçbir değişiklik yoktu.
2 dk daha santrifüje tabii tuttum, bu sefer bazı tohum kapçık uçlarının kırıldığını hafif dağıldığını gördüm ama genel bütünlük bozulmamıştı ve tohumun ortasında görülen yoğun bölgede dağılmamıştı. Bu şekilde çimlenmelerinde bir sorun oluşmazmış gibi geldi bana.

Sertliklerini anlamak için mikroskopta bakarken pipetin ucuyla ezme denemesi yaptım, ilgiçtir, hemen ezildi ve içinden o yoğun bölge dediğim yerden bir sürü küçük partikül yayıldı. Patlayan tohum oldukça farklıydı diğerlerinden. Santifüj sonucu patlasaydı mutlaka belli olurdu. Bunun sonucunda tohumların santrifüjden etkilenmediğine karar verdim. Fotoğraflarını çektim, yarın ekliyebileceğim görüntüleri.

Yine yarın tohumları hem hidrojen peroksitli, hem de santfifüjlü yöntemlerle steril edip kültüre edeceğim. Bu işlemlerinde fotolarını bir aksilik olmazsa yarın yüklerim.


Saygılarımla

[Cansunarya]

Herkese selamlar,
Bugün laboratuarda bir çığlık attım, ne kadar mutlu olduğumu anlatamam..Bu kadar geçen aydan sonra neredeyse bir gün içinde beklediğim kökün çıkmış olması beni çok şaşırttı Kültürleri hergün dikkatli bir şekilde inceliyorum, daha önce bahsettiğim kültürden kök beklerken başka bir kültür kök çıkardı..dün yoktu böyle bir kök, demekki çok hızlı gelişim gösteriyorlar..

Köklenen keiki burada anlattığım rutin prosedürler altında inkübe edildi, aynı kavanozda tutulan kardeş keikide gelişim yok. Uzun bir süredir aktif kömür içerikli olan vasat içerisinde. Deneme amacıyla şeffaf ilk besi yerine aldığım kültürlerde ve karanlıktan yeni çıkarttıklarımda gelişim yok.

Yarın Ankara ya gidiyorum, bayram sonunda döneceğim, dönüşte nasıl olacaklarını şimdiden çok merak ediyorum

Buradan herkesin Ramazan-Şeker Bayramını şimdiden kutlarım Nice bayramlara...

Sevgi ve saygılarımla

[Cansunarya]

Herkese iyi günler,
Tatilden henüz döndüm ve önceden söz verdiğim fotoları ancak bugün ekleyebiliyorum.

Tohum kültürlerini yola çıkmadan bir gün önce yaptım. Umarım herhangibir kontaminasyon yoktur. Sonucu ancak yarın görebileceğim.

Foto 1 Praecox hocamın gönderdiği Phal tohum paketleri
Milyonlarca tohum içeren paketlerin herbirinden ön deneme amacıyla bistüri ucuyla ufak bir miktar alarak steril tüplere aktardım. Tohumların nekadar küçük oldukları görülebiliyor.

[Cansunarya]

Phal tohumlarının mikroskop altındaki görüntüleri
5. Foto da yüksek santrifüj sonucu tohum uçlarında oluşan kırılmalar görülmekte..fakat ortalarındaki yoğun bölge normal görünüyor, canlı olup olmadıkları kültür sonrası belli olacak.

[Cansunarya]

Yaptığım araştırmalarda tohumların sterilizasyonu için en uygun yöntemin sukroz-hidrojen peroksit yöntemi olduğuna karar verdim. Sukrozu yeni temin ettiğim için bu işlemi bir sonraki aşamada uygulayacağım.
Bu yöntemde tohumlar küçük kağıt paketler şeklinde paketlenerek yoğun sukroz çözeltisinde 12 saat tutuluyor. Amaç ortamdaki sporların açılarak vejetatif forma geçmesi. Sonrasında %3 lük Hidrojen peroksitte 15 dk bekletilen paketler (açılan sporlar, mantar vs bu sürede yok ediliyor) , steril distile sulardan geçiriliyor, açılarak içindeki steril olmuş tohumlar kültürde kullanılıyor.

Bu normal yapılan prosedür. Bense biraz farklı bir yol denedim (Malesef ). Kağıt paketle uğraşmaktansa tohumları küçük tüplerde peroksitle muamele edip en düşük devirde santrifüj ederek çökmelerini sağlayacak ve üstteki per. i uzaklaştırarak aynı şekilde birkaç kere yıkayacaktım. Bir tüpüde daha önceki yazılarımda belirttiğim gibi deneme amaçlı yüksek devirde santrifüj edecektim.

Fakat düşündüğüm gibi olmadı Tohum tüplerine per. ekleyip iyice vortexledim (karıştırıcı foto1) 1000 devirde 1dk santrifüj ettim, atladığım nokta tohumların çok hafif olmalarıydı, çökmediler tabii, 2000 e aldım, olmadı, 3000 e aldım olmadı, 8000 devirde 10dk santifüj ettim yine çökmediler, en son dayanamayıp yine 15000 devirde sant. ettim. Bir kısmı çökmüş bir kısmıda hala yüzeyde yüzüyordu. Hemen üstteki sıvıyı uzaklaştırdım, iki kere steril distile su ile yıkama işlemi yaptım, yine 15000 devirde santrifüj ettim. Bunlar daha iyi çökmüştü. Hidrojen peroksitin devamlı gaz kabarcığı oluşturması tohumların çökmesini engelliyordu. Sonuç olarak tohumlar yoğun bir santrifüj basıncına maruz kaldı.

Sterilizasyondan sonra daha önceden hazırladığım aktif kömürlü P6668 besi yerininden steril petrilere 20 cc kadar koyarak ekim yeri hazırladım. Herbir tüpteki tohumları biraz steril su ile sulandırarak birer agarın üzerine ektim. Işık kaynağı altında 12/12 saat olacak şekilde inkübasyona aldım. Sonucu bende merak ediyorum Yarın mikroskopta canlılık muayenesi yapacağım, bakalım o basınçtan sağ çıkabilmişlermi

En kısa zamanda da sukroz-peroksit yöntemini deniyceğim, tabii kağıt paketlerde..

Güncelleme: İleri mesajlarda da görüleceği gibi uyguladığım bu yöntem başarılı oldu. 7 ye 1 kontaminasyon var 6 petri sağlıklı gelişme gösterdi, yani bu santrifüj yöntemini bundan sonrada kullanabilirim. Sizler için kağıt paketler yine en uygunu olacaktır.

[praecox]

Ben genelde "Çok güzel bir çalışma olmuş" gibilerden mesajlar yazmasını seven biri değilim. (Malum Moderatörüz ve bu tarz mesajlar konu başlığını şişirip irite ediyor kanısındayız)

Ama bu resimler karşısında açıkçası dayanamadım. Özalikle de tohumların mikroscope daki resimlerin çekilerek dökümante edilmesi karşısında...
Ne güzel bu görüntüler artık benim gözüme özel kalmadı herkeslere de gördüklerimi görebiliyorlar artık. (Benim evdeki mikroscope umda resim çekme olasılığım yok da...)

Bu dökümantasyon için sayın Cansunarya'ya bunları bizlerel paylaştığı için çok teşekkür ederim.