Yaptığım araştırmalarda tohumların sterilizasyonu için en uygun yöntemin sukroz-hidrojen peroksit yöntemi olduğuna karar verdim. Sukrozu yeni temin ettiğim için bu işlemi bir sonraki aşamada uygulayacağım.
Bu yöntemde tohumlar küçük kağıt paketler şeklinde paketlenerek yoğun sukroz çözeltisinde 12 saat tutuluyor. Amaç ortamdaki sporların açılarak vejetatif forma geçmesi. Sonrasında %3 lük Hidrojen peroksitte 15 dk bekletilen paketler (açılan sporlar, mantar vs bu sürede yok ediliyor) , steril distile sulardan geçiriliyor, açılarak içindeki steril olmuş tohumlar kültürde kullanılıyor.
Bu normal yapılan prosedür. Bense biraz farklı bir yol denedim (Malesef
). Kağıt paketle uğraşmaktansa tohumları küçük tüplerde peroksitle muamele edip en düşük devirde santrifüj ederek çökmelerini sağlayacak ve üstteki per. i uzaklaştırarak aynı şekilde birkaç kere yıkayacaktım. Bir tüpüde daha önceki yazılarımda belirttiğim gibi deneme amaçlı yüksek devirde santrifüj edecektim.
Fakat düşündüğüm gibi olmadı
Tohum tüplerine per. ekleyip iyice vortexledim (karıştırıcı foto1) 1000 devirde 1dk santrifüj ettim, atladığım nokta tohumların çok hafif olmalarıydı, çökmediler tabii, 2000 e aldım, olmadı, 3000 e aldım olmadı, 8000 devirde 10dk santifüj ettim yine çökmediler, en son dayanamayıp yine 15000 devirde sant. ettim. Bir kısmı çökmüş bir kısmıda hala yüzeyde yüzüyordu. Hemen üstteki sıvıyı uzaklaştırdım, iki kere steril distile su ile yıkama işlemi yaptım, yine 15000 devirde santrifüj ettim. Bunlar daha iyi çökmüştü. Hidrojen peroksitin devamlı gaz kabarcığı oluşturması tohumların çökmesini engelliyordu. Sonuç olarak tohumlar yoğun bir santrifüj basıncına maruz kaldı.
Sterilizasyondan sonra daha önceden hazırladığım aktif kömürlü P6668 besi yerininden steril petrilere 20 cc kadar koyarak ekim yeri hazırladım. Herbir tüpteki tohumları biraz steril su ile sulandırarak birer agarın üzerine ektim. Işık kaynağı altında 12/12 saat olacak şekilde inkübasyona aldım. Sonucu bende merak ediyorum
Yarın mikroskopta canlılık muayenesi yapacağım, bakalım o basınçtan sağ çıkabilmişlermi
En kısa zamanda da sukroz-peroksit yöntemini deniyceğim,
tabii kağıt paketlerde..
Güncelleme: İleri mesajlarda da görüleceği gibi uyguladığım bu yöntem başarılı oldu. 7 ye 1 kontaminasyon var 6 petri sağlıklı gelişme gösterdi, yani bu santrifüj yöntemini bundan sonrada kullanabilirim. Sizler için kağıt paketler yine en uygunu olacaktır.