Bitki Doku Kültürü Çalışmaları

[Cansunarya]

İyi günler, bir süredir Afyon daydım, bugün geldim..
Sayın Ephesos, Orkide kültürü için geliştirilmiş farklı markalarda besi yerleri var, bunlar literatüre ilk kim eklemişse o isimle anılıyor, aynı ürünü farklı firmalarda farklı isimlerle bulabilmek mümkün. Sigma benim kendi alanımdada kulladığım, güvendiğim bir marka, bu yüzden bunu tercih ettim.
Sigmanın Phytamax tescilli orkide besi yerleri var (3.) katoloğa baktığımda MS besi yerlerini tamamen ayrı alana aldıklarını gördüm. Sanırım benim kullandıklarım MS den farklı, Knudson C nin besi yerinden modifiye edilmiş, ama geniş bir şekilde araştıramadım, emin değilim, belki hocalarımız daha iyi bilirler.
Aşağıda kullandığım iki besi yerinin bileşimleri var. Ben henüz ilk denemelerim olduğu için bunlar üzerinde hiç modifikasyon yapmadım. Pdf lerin 2. sayfasında hangi oranlarda nasıl hazırlandığı bildirilmiş. Anlayacağınız gibi ekstra birşey yapmayıp tamamen hazıra kaçıyorum, Türk usulü
Phytamaxlar arasında muz veya hindistan cevizi ekstraktlı olanları var, aslında çoğu literatürlerde oldukça başırılı olan besi yerleri bunlar. İleride onlardanda alıp deneme yapmak istiyorum. Size daha önceki mesajlarda web adresini verdiğim Lotte ve Thomas yöntemini tavsiye ederim, eğer prosedürde veya çeviride sıkıntınız olursa da yardımcı olabilirim.


http://www.sigmaaldrich.com/sigma/da...t/p6793dat.pdf
http://www.sigmaaldrich.com/sigma/da...t/p6668dat.pdf
http://www.sigmaaldrich.com/sigma/ge...id%20media.pdf

[Cansunarya]

Geçen hafta çarşamba çekilmiş pasaj fotolarını yeni yayınlayabiliyorum. Tüplerde fenolik eksudasyonun yanısıra opaklaşmada mevcut. İki kültürden biri iki küçük yaprağa sahip, diğeride henüz yaprak çıkarıyor. Bİr kültürde de (4.) çiçek sapına dönüşecekmiş gibi bir görüntü var.

[Cansunarya]

Bu aşamada toplam 9 nod kültürünün pasajı yapıldı. Kültürleri yine steril bir ortamda çıkardıktan sonra 7 tanesini henüz yaprak gelişimi olmadığı için tekrar P6793 besi yerine aldım. 2 taneside (biri iki yapraklı) kök gelişimi için P6668 aktif kömür içeren besi yerine geçtim. Ne kadar heyecanlandığımı anlatamam, çook mutluyum Pasaj aşamasının küçük bir videosunuda çektim, you tube a eklemeye çalışıyorum

[akgb]

Süperler Çalışmaların sonuçlarını iple çekiyorum...

[praecox]

Sayın cansunarya,
bu kadar phenolic exudation normal göremiyorum. belki ben yanlışım.
Ama ben kendi adıma bunları bu sıklıkta yaşamadım diye hatırlıyor gibiyim. sebebi ne olabilir ... düşünüyorum....

[Cansunarya]

Evet, banada pek normal görünmüyor, özellikle jelin şeffaf yapısını kaybedip bulanıklaşması pek hoşuma gitmedi ama kontaminasyon gibi de değil sanki. (Bu arada konuya yabancı arkadaşlar için belirteyim; mavi kapaklı cam şişedeki siyah agar; agar kömür içerikli olduğu içindir. Bir önceki mesajda plastik tüplerdeki siyahlaşma ise fenolik eksudasyon)
Bu konuda aşağıdaki web sitesinde demir eksikliğinden kaynaklanabileceği belirtilmiş ama oranlara baktığımda demir sülfat normal sınırda görünüyor.
Hem kültür öncesi hemde kültür sırasında Askorbik asit ilavesi tavsiye edilmiş, birsonraki sefere bunu deneyebilirim.
Bu web sayfasında Epheesos unda dikkatini çekebilecek farklı orkide medium bileşenleri var. Güzel bir site..
http://www.beffo.se/marax/index.php?...d=14&Itemid=26

Hocam şimdi aklıma geldi; kullandığım nodlar koyu pembe bir phale ait, ilk kültüre aldığımda kestiğim yerlerden jele pembemsi-eflatun bir renk yayıldı, giderek yoğunlaşarak siyahlaştı..Aşağıyada ekliyorum fotoyu biraz belli belirsiz ama hemen kesim hattında.. Acaba orkidenin renk bileşimi fenolik eksudasyon olarak bize gerimi dönüyor, bende yüksek sesle düşündüm şimdi..

[praecox]

Olabilir. Pembeye giden renklerin çiçek sapları ve yaprakları da o derece bir koyu pembelik hakim olur, ancak bunun özsuyuna geçip agarı da boyaması düşündürücü. desenfektasyondan sonra yeterince yıkamıyormusunuz acaba. ben nod'larda hala chlorlu bir desenfektasyondan taraf değilim. Hydrogenperoxit % 3,0'lük 3-5 dk bekletilemsi sonra değişik üç kapta steril destile suda yine en az bu sürelerde bekletmek kaydı ile yıkamak uygun olur kanısındayım.

Şayet hypochlorit ile dezenfecte ederseniz de sonradan steril kabinde steril şartlarda bir 3-5 mm kadar daha sap almanız gerekir. Bunun için de nod,ları baştan uzun tutun.
Besi yerine ektikten sonraki çevre şartlarınız nedir? ısı ışık gibi?
Bir de kaplarınız Phal. gözlerinden nod kültürü için fazlaca ufak olduğunu düşünüyorum. Gaz alışverişini sağlıyan bir düzenek var mı kapakta? Bazı resimlerde jelin kuruduğu da görülüyor.
Doğru mu?

[ephesos]

Sayın Cansunarya hocam tavsiyeleriniz için çok teşekkürler.
Acaba kültüre alacağımız çiçek sapını göz göz ayırmadan steril etsek daha sonra steril ortamda ayırsak , böylece hpokloritin özsuyuna karışma ihtimalini azaltmaz mıyız ?
Böyle yapmamızın sakıncası varsa nedir ?

[Selahattin Yılmaz]

Hazır besi aldık diyelim, bu besi yeri nasıl hazırlanıyor tarif edermisiniz?

[Cansunarya]

Nodun bulunduğu sapları yaklaşık 10-12 cm civarında kesiyorum. Tamamını 50 cc lik bir tüpe koyup 20-30 dk kadar hipoklorit solusyonunda beklettikten sonra tüm olarak 4 kez steril distile su ile yıkıyorum. Parçaları 10-12 cm lik petrilere alarak orada küçük parçalar halinde keserek tüplere öyle geçiyorum. Bu fotoların devamını 25,26,27. mesajlarda eklemiştim. Dolayısıyla kesit yüzleri ekstra bir yıkama yapılmadan agara geçiliyor ve sanırım buradaki parçalanan dokulardan bu eksudat çıkıyor. Yoksa hipokloritli doku iyice beyazlaşıyor buralardan da yaklaşık 1 cm kadar doku uzaklaştırıp, atıyorum.
Işık için 80 watt lık bir masa lambası kullanıyorum. 20/4 saat açık kalıyor. Normalde şimdiye kadar 20+-4 derecede duruyorlardı ama havalar ısındığı için bu aralar laboratuarda ısı biraz yüksek. Kendilerini toparladıklarında evimde onlara daha uygun bir ısı sağlayabilirim, malum Kayseri, kuzey cepheler serin oluyor
Nodları koyduğum tüpler gerçekten küçük, 1,8-2 cc lik tüpler, bazı nodları agara gömmemek adına 0,5 cc lik besi yeri ile kültüre etmek zorunda kaldım. Aslında şimdiye kadar yaklaşık bir hafta arayla agar değişimi yaptım ama tüpte bukadar az besi yeri varken son günlere doğru agar biraz kuruyor. Kullandıklarım vidalı cryotüpler, vidalı olunca çok hafif gevşek bırakıyorum ağzını, ventilizasyonlu büyük flasklarım var onlarıda iyice yapraklanınca kullanmayı düşünüyorum.

[Cansunarya]

Orijinal Mesaj Sahibi Selahattin YILMAZ

Hazır besi aldık diyelim, bu besi yeri nasıl hazırlanıyor tarif edermisiniz?

Selahattin hocam, besi yerlerini 50 cc lik hazırlıyorum.
Örneğin P6793 besi yerinin üzerinde litreye 25.3 gr hazırlanmalı diye yazıyor, Otoklavlanabilir bir şişeye 1.265 gr tartıp 50 cc den az (yaklaşık 40 cc) distile su ilave ediliyor.
Bunlar agar içermediği için 6-7 gr /lt (0,35 gr) agaroz kattım (bu aşamada mediumda yoksa sukroz, BA, IBA veya NAA eklenebilir, bu mediumda hepsi vardı)
pH NaOH veya HCL ile 5.6 ayarlanıyor.
Üzeri 50 cc ye tamamlanarak 121 C de 15 dk otoklav ediliyor
Buzdolabında saklayıp kullanımdan önce mikrodalga ile eritiyorum. Bu prosedürü 58 nolu mesajdaki linkte daha ayrıntılı bulabilirsiniz.

[Cansunarya]

Bugün son 5 gündür görmediğim kültürlerimi kontrole gittiğimde çok heyecanlandım. Kontamine oldularmı, büyüdülermi, köklendilermi acaba derken bana süpriz yaptılar, 9 kültürün 6 sında ikinci bir yaprak (yeni filiz) gelişimi vardı yani bir noddan iki keiki alabilicem inşallah. İki yapraklı olan yavrumda 4 yapraklı oluvermiş Fotolarda nod filizlerinin yanlarından çıkan yeni filizler görebilirsiniz, ama henüz kök gelişimi yok..

[ephesos]

Orijinal Mesaj Sahibi Cansunarya

Selahattin hocam, besi yerlerini 50 cc lik hazırlıyorum.
Örneğin P6793 besi yerinin üzerinde litreye 25.3 gr hazırlanmalı diye yazıyor, Otoklavlanabilir bir şişeye 1.265 gr tartıp 50 cc den az (yaklaşık 40 cc) distile su ilave ediliyor.
Bunlar agar içermediği için %6-7 gr /lt (0,35 gr) agaroz kattım (bu aşamada mediumda yoksa sukroz, BA, IBA veya NAA eklenebilir, bu mediumda hepsi vardı)
pH NaOH veya HCL ile 5.6 ayarlanıyor.
Üzeri 50 cc ye tamamlanarak 121 C de 15 dk otoklav ediliyor
Buzdolabında saklayıp kullanımdan önce mikrodalga ile eritiyorum. Bu prosedürü 58 nolu mesajdaki linkte daha ayrıntılı bulabilirsiniz.

Sayın hocam P6793 besi yeri içerisinde pepton varken neden agaroz katma ihtiyacı duydunuz , aynı olayı tomas & lotte nin sitesindede gördüm nedenini açıklarmısınız hocam , teşekkürler.

[ephesos]

Tebrikler hocam yolun sonuna geldiniz nihayet bence güneşe alın sıra köklerde 1 haftaya görürsünüz.

[Cansunarya]

Orijinal Mesaj Sahibi ephesos

Tebrikler hocam yolun sonuna geldiniz nihayet bence güneşe alın sıra köklerde 1 haftaya görürsünüz.

Teşekkürler Ephesos, havalar bu aralar çok düzensiz gittiği için köklenene kadar yine ışık kaynağı altında tutmayı düşünüyorum, henüz kök yok ama giderek büyüyorlar Sizin kültür konusunda hazırlıklarınız varmı, ne zaman başlamayı düşünüyorsunuz?

Pepton bitkilerin ve pekçok mikroorganizmanın üretiminde besi kaynağı (Proteinlerin parçalanmış hali, amino asit kaynağı) olarak kullanılıyor, jel özelliği bulunmuyor. Agaroz ise sadece besi yerini jelatinöz hale getirmeye yarıyor, herhangi besleyici bir özelliği yok. İlk kullandığımda içerisinde agar olmadığına dikkat etmemiştim , otoklav sonrası besi yeri sıvı halde kaldı tabii bu şekilde kullanımıda oldukça zor.

Bu arada video görüntülerini ekleyemiyorum. Youtube a üye oldum ama üyeliği bir türlü onaylamıyor, web sayfasına da bağlanmıyor. Acaba bu videoları nereye ekleyebilirim bilen varmı...

[ephesos]

Teşekkürler hocam , oysaki ben peptonların agar gibi katılaştırıcı bir özelliğinin olabileceğini düşünmüştüm.
Şu an araştırma safhasındayım çeviriler falan var onlarla uğraşıyorum temin ettiğim Türkçe kaynakları inceliyorum .
Çocukluğumun hayelleri depreşti biyolojiyi çok seviyordum hala ilkgünki gibide seviyorum bu konuda öğrenmeye doymuyorum sevdiği işi yapmak kadar insanı mutlandıracak başka birşey yok hocam.

[Cansunarya]

Rica ederim..Haklısınız insan hayallerini gerçekleştirebildiği ölçüde mutlu oluyor. Çevremdeki insanlar 'senin işin gücün yokmu bunlarla uğraşıyorsun' gibi şeyler söyleselerde ben çok mutluyum onlarada aldırmıyorum..ve bunu anlayacak sizler gibi insanlarla paylaşmaktan daha da büyük mutluluk duyuyorum ..

[Cansunarya]

Bu aralar kaktüs hücre kültürüne odaklandım, aşağıdaki webde aşamalarıyla verilmiş ve yaklaşık bir ayda yavru kaktüsler elde edilmiş..ama kullanılan besi yeri hakkında bilgi yok...

http://www.shroomery.org/forums/show...b/9/fpart/all/

[ephesos]

Ummadığın taş baş yararmış hocam .

[Cansunarya]

Evet, öyle gerçekten..Umarım keiki çıkarır..

Aşağıdaki linkte doku kültürü hakkında kullanışlı bilgiler var

http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_...Protocols.html

[ephesos]

Sayın hocam agarla agaroz arasında ne fark var hocam , bildiğim kadarı ile agaroz elektrophoresis işlemi için kullanılıyor normal agar ın agaroza göre eksi bir yanımı var **** agarozun agardan dahafazla biryanı mı var ? birde hocam besi yerinin hazırlamasında verdiğiniz formülde litreye %6-7 gr /lt (0,35 gr) demişsiniz hocam bunu biraz açarmısınız ?

[Cansunarya]

Agaroza genel kullanımda agarda denilmektedir, aslında kısmen ayrı şeylerdir. Agar deniz yosunundan elde edilmiş bir maddedir, genelde sarımsı, kötü kokulu (bence), hafif granülümsü olurlar. Otoklav edildiğindede sarımsı-jelatinöz bir yapı oluşturur. Pekçok mikroorganizmanın üretiminde temel besi yeri olarak kullanılır, bu yüzden kısa zamanda bakteri, mantar, küf vs. üretebilir. Agaroz ise agardan ekstrakte edilen bir polisakkarittir, beyaz, kokusuz toz şeklindedir. Kolayca kontamine olmaz. Dediğiniz gibi elektroforez, PCR v.b moleküler tekniklerde kullanılır.
çok dikkatlisiniz, düzeltme yaparken gözümden kaçmış hemen düzeltiyorum, doğrusu 6-7gr/lt olacak.. Teşekkürler

[livingdead]

Orijinal Mesaj Sahibi Cansunarya

Agaroza genel kullanımda agarda denilmektedir, aslında kısmen ayrı şeylerdir. Agar deniz yosunundan elde edilmiş bir maddedir, genelde sarımsı, kötü kokulu (bence), hafif granülümsü olurlar. Otoklav edildiğindede sarımsı-jelatinöz bir yapı oluşturur. Pekçok mikroorganizmanın üretiminde temel besi yeri olarak kullanılır, bu yüzden kısa zamanda bakteri, mantar, küf vs. üretebilir. Agaroz ise agardan ekstrakte edilen bir polisakkarittir, beyaz, kokusuz toz şeklindedir. Kolayca kontamine olmaz. Dediğiniz gibi elektroforez, PCR v.b moleküler tekniklerde kullanılır.
çok dikkatlisiniz, düzeltme yaparken gözümden kaçmış hemen düzeltiyorum, doğrusu 6-7gr/lt olacak.. Teşekkürler

Sayın hocam agar aldım ama internetten doku kültürü için kullana bilirmiyim yani agaroz olmasımı gerekir illa sterlize etmek için mikrodalgada nekadar süre tutmam gerekir besiyerimi yardımcı olursanız çok memnun olurum

[caturanga]

Sn. livingdead sadece besiyerini steril etmek yetmez.aynı zamanda explant sterilizasyonuda gerekir.doku kültüründe dal köklendirme diye birşey yok.çoğaltılan mikro sürgüncüklerin köklendirilmesi var.

[livingdead1978]

Orijinal Mesaj Sahibi livingdead

Sayın hocam agar aldım ama internetten doku kültürü için kullana bilirmiyim yani agaroz olmasımı gerekir illa sterlize etmek için mikrodalgada nekadar süre tutmam gerekir besiyerimi yardımcı olursanız çok memnun olurum

sizden ögrenmek istedigim hocam genelde internet üzerinde besiyet sterlize ederken düdüklü tenzere kullanımış düdüklü tencere ile sterlize hakkında bilgi bula biliyorum lakin mikrodalga ile sterlize etmek hakkında bilgi bulamıyorum bu konuda bana yardımcı olursanız çok memnun olurum mikro dalga alırken dijitalmi almamız gerekiyor genelde üzerinde farklı rogram seçenekleri var nasıl kullanırız neye dikkat etmemiz gerekir bilgi verirseniz çok memnun olurum iyi çalışmalar dilerim

[ephesos]

Hocsm umarım başınızı ağırtmıyorumdur sorularımla , agarozu tavsiye edersiniz anladım.Birde malum bu 6 / 7 gramı nasıl ayarlayacağım buda sorun bunu ( cc ) cinsinden belirleyebilirmisiniz agar ve agaroz u ? teşekkürler hocam.

[Cansunarya]

Rica ederim, öyle düşünmeyin..Agaroz kullanımı daha iyi olur. Besi yeri hazırlarken eğer seri üretim yapılmayacaksa litre olarak hazırlanmasını tavsiye etmiyorum, 50 ml yetebilir size diye düşünüyorum. cc de sıvılar için kullanılan bir birim, bu yüzden belirli bir ölçü veremiyorum. Ama birkaç gün içinde laboratuarda tartıp sizin kolayca bulabileceğiniz ölçüler oluşturabilirim, belki çay kaşığı ucuyla falan olabilir, bir deneyeyim bakayım. .

[praecox]

Sanırım sayın ephesos'un hassas tartısı yok. Onun için tozu ml veya cc cinsinden soruyor. Burda ben iki sorun görüyorum.
1. cc cinsinden yani hacım/ağırlık relasyonu (ki sıvılarda yoğunluk anlamına da geliyor) tozların granül veya kristal cinsine göre aynı prosesden çıkma bir toz dahi olsa charge dan charge değişkenlik gösteriyor.
Özelikle de 1 litre değil de daha az miktarları tartım dışında ölçmek çok da mümkün olmıyacağa benzer. Bu konuda belki yakındaki bir eczaneden yardım alabilirsiniz. Hoş ben geçende bir GA3 tartımı için gittiğimde poşet içindeki beyaz toz adamı bir şekilde alarma geçirdi. Başınıza bir iş almak bu bağlamda çok basit. analizi yapılana dek sürünmek de var.
2. Besi yeri hazır karışımları ki sigmada 1 litrelik hazır karışımlar burdan da tartım almak öncelikle hygroskopik olan bakiyenin bir exicatörde (desicatör) saklanması tavsiye edilir. diğer tarfdan ise toz karışımların üniformitesi herzaman bir sorun olmuştur. toz karışımların içindeki tuzların granülasyon veya kristalizasyon faklılıklarınden karışımın üniformitesi her silkelemekle bozulamktadır. Kuru kuruya karıştırıp almak da iyi bir çözüm değil.Sıvılarda karıştırmak üniformiteyi sağlasa da toz karışımlarda fazla karıştırmanın da sorun olduğunu çok iyi biliyorum. İlaç toz karışımların baskıya hazır karışım için granülasyonun üniformitesi Kalite güvencenin ve kalite kontrolun ciddi vaildasyonları gerekitren bir sorunudur.
Sigmann besi yerleri bu bağlamda bir granülasyon olup olmadıklarını bilmiyorum ama sanmıyorum. İncelemedim açıkçası.
Sayın cansunarya belki bize bu konuda bilgi verebilir.

Saygılar

[ephesos]

Sayın hocalarım ikinizede çok teşekkür ederim ama cc ve ml nin nerede **** hangi tür maddelerin ölçümünde kullanıldığına şükür vakıfım sayın preacoxun dediği gibi 1 litre ile 1 kg nın aynı hacimde olmalarını beklemiyorum ben bana kolaylık olsun diye şöyle düşündüm bir şırınga alırız tartılmış 7 gramlık agarı **** agarozu bu şırınganın içine boşaltırız ve yaklaşık kaç cc olduğunu anlaya biliriz birkaç dizyemlik şaşmalar sanırım onarılması imkansız sonuçlar doğurmayacaktır hem bu işlem yemektarifi yaparmış gibi çaykaşığı , çimdik , tutam gibi ifadelerden kurtaracaktır , alıpta poşet içerisindeki bir maddeyi eczaneye **** hassas tartısı olan biryere götürüp tarttırmayı gözüm yemiyor , bu zaten sonucu bellibir keşmekeş.

[praecox]

Onu ("g" v.s "ml") bilebileceğiniz de benim malumalimdir se de... sanırım anlatamadım.

Örneğin 100 ml besiyeri hazırlıyacak iseniz. Buna örneğin P6793 için 25,3/10 yani 2,53 g almanız gerekir. Buna ilaveten de tkrb. 0,6 g agar ekliyeceksiniz.

Diyelim P6793'ün 2,53g = 2,1ml (Tamaen atıyorum bu değerlerde) agarı da 0,6g = 1 ml önce bunları nasıl ölçeceksiniz? Varsayalım bunu da % 10 hata payı ile başardınız, veya agrı az **** çok katınız yine sorun yok. Ancak P 6793'ün 25,3 g'lık kabın içinden homogen bir toz karışım almanız mümkün mü onu da ben bilemiyorum.

Ya ilaa olur yapılır olmaz diye bir şey yok hatta sorun da olmıyabilir de ancak ben hem senthetik hemde çok hassas anayltik çalışmış bir akademisyen olarak belki de çok fazla ince, detaycı düşünüyorumdur....
haklı olabilirsiniz. Ancak ben eğitimim gereği bu şekilde düşünüyorum. Kimyada farmada bu tarz yakıştır yapıştır yapmıya hiç yanaşmadım ama dediğim gibi bu benim sorunum.