Evde ve okullarda hobi amaçlı bitki doku kültürü

[sarıpapatya]

EVDE VE OKULLARDA HOBİ AMAÇLI BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ

Özet

Bitki biyoteknolojisini oluşturan iki unsur olan bitki doku kültürü ve bitki genetik mühendisliği hem ticari hem hobi hem de araştırma bazında rutin olarak uygulanmaya başlanmıştır. Bitki doku, hücre veya organlarının laboratuvarda kontrollü ve steril şartlarda çeşitli besin ortamlarında kültüre alınması, onlardan yeni hücreler, dokular, organlar veya yeni bitkiler üretilmesi işlemlerinin tütüne birden bitki doku kültürü denilmektedir.

Genellikle bitkilerin yaprak, gövde veya köklerinden alınan parçalarındaki vücut hücrelerinin özel besin ortamlarında kültüre alınması yoluyla uygulanır. En çok karşılaşılan uygulama hücrelerde, o hücrelerin alındığı bitkiye benzer bitki veya bitkiler üretmektir. Buna rejenerasyon denilir. Ayrıca tek başına hücreler veya organlar (örnek: kökler) çoğaltılabilir ve çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Bu işlem bitkilerin amaca uygun olarak genetik yönden değiştirilmesine de imkan sağlamaktadır.

Bu yayında amaç evlerde, lise ve dengi okullarda veya üniversite lisans seviyelerinde bitki doku kültürüne ilgi duyanlara doku kültürünün temel mekanizmasını anlatmak, basit doku kültürü tekniklerini kendilerinin uygulayabilmesi açısından açılımlar getirmektir.

Evde bu işlemleri yapanlar hem kendilerine iyi bir vakit geçirme, hem de istedikleri bitkileri çoğaltabilme imkanı sağlayacak, ilköğretim çağında olan öğrenciler bitkilerin üreme, çoğalma ve büyümesi ile ilgili bilgileri kendilerinin deneyerek öğrenmelerini sağlamaktır. Ayrıca burada bahsedilen teknikler ticari amaçlı olarak üretim yapacaklara da kısmen ışık tutabilir.

Daha geniş bilgi almak isteyenler Bitki Biyoteknolojisi Cilt I Doku Kültürü ve Uygulamaları (M. Babaoğlu, E. Gürel, s. Özcan; Editörler, Selçuk Üniversitesi Yayınları, 2001) adlı kitaptan faydalanabilirler.


1. Giriş
Bitki doku kültürü; aseptik (steril) şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları=eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir (Babaoğlu ve ark., 2001).

Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik çeşitlilik oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır.
Bitki doku kültürü ile ilgili önemli çalışmalar Tablo 1’de verilmiştir.


Tablo 1. Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar (Babaoğlu ve ark., 2001).
Tarih Çalışmalar Araştırıcılar
1902 İlk izole hücrelerin kültürü Haberlandt
1904 Olgun embriyoların kültürü Hanning
1917 Biyoteknoloji teriminin ilk defa kullanımı Karl Ereky
1920 Oksin hormonunun keşfi ve tanımlanması Went ve ark.
1922 Kök ve sürgün uçlarının tek başına laboratuvarda çoğaltımı Kotte ve Robbins
1924 İlk embriyo kurtarma tekniği (mısır) Dieterich
1934 İlk sürekli olarak tek başına çoğalan kök kültürleri (domates) White
1934 İlk kallus (değişmeden bölünüp çoğalan hücre topluluğu) kültürleri Gautheret
1942 İlk kallus kültürlerinden sekonder metabolit eldesi Gautheret
1946 İlk sürgün uçlarından (apikal meristem) bitki eldesi Ball
1953 DNA'nın yapısının belirlenmesi Watson ve Crick
1954 İlk hücre süspansiyonlarından bitki eldesi Muir ve ark.
1957 İlk sitokinin hormonunun tanımlanması ve öneminin ortaya konulması Skoog ve Miller
1958 İlk somatik embriyogenesis (havuç) Steward ve ark.
1960 Enzimler kullanılarak ilk canlı protoplast izolasyonu Cocking
1962 MS doku kültürü besin ortamının geliştirilmesi Murashige ve Skoog
1965 Tek hücreden bitki elde etme (rejenerasyon) Vasil ve Hilderbrandt
1967 İlk haploid bitkinin üretimi (anter polen kültürü) Bourgin ve Nitsch
1968 B5 ortamının geliştirilmesi Gamborg ve ark.
1970 HEPA filtrelerin kullanılmaya başlanması
1978 Cinsler arası ilk somatik melezleme Melchers ve ark.
1983-86 Transgenik ilk bitkinin elde edilmesi ve tarla testleri (tütün) Murai ve ark.
1990 Sentetik tohum geliştirme ve hızlı dondurma yoluyla germplazm muhafazası çalışmalarının başlaması -
1995 İlk rekombinant (genetik olarak değiştirilmiş) insan gıdası (Flavr Savr, domates)

Bitki biyoteknolojisi doku kültürü ve genetik mühendisliği olarak 2 unsurdan oluşmaktadır. Aslında Tablo’dan da görüleceği gibi biyoteknoloji yeni bir kavram değildir. 1950'li yıllarda Hoagland ve Arnon "Hoagland Çözeltisini" geliştirerek bitkilerin topraksız ortamda da büyüyebileceğini göstermelerinden sonra, bu çözelti azot, fosfor, potasyum, mangan, demir, bakır, çinko, bor, magnezyum, kükürt, kobalt gibi bitkiler için önemli olan 11 adet mineral tuz içermekteydi. Uzun yıllar su kültüründe (hidrofonik) sebze yetiştirmede kullanılmış ve hala topraksız tarımda kullanılmaktadır.

Bitkilerin laboratuvarda veya kontrollü şartlarda fazlaca miktarda çoğaltılması (mikro çoğaltım, klonal çoğaltım) klasik usullerle bitki üretimine önemli bir alternatiftir. Mikro çoğaltma çevre ve besin kontrolü yapılabilen steril (mikroorganizma, toz vb. ihtiva etmeyen) yetiştirme şartlarında bir bitkinin tomurcuk, boğum, yaprak ve kök parçaları gibi çeşitli yerlerinden alınan küçük parçalarının (eksplant) kültürü sonucu yeni bitkilerin üretilmesidir. Üretilen bitkiler her bakımdan birbirinin aynısıdırlar. Yani yapılan bu iş bitki klonlaması veya genetik kopyalamadır.

Normal olarak bilimsel araştırma laboratuvarlarında doku kültürü ile bitki üretimi için genellikle pahalı aletler kullanılır. Fakat bu yazıda bu aletlerin yerine çarşı ve pazardan kolaylıkla elde edilebilecek sıradan ev aletleri kullanılarak doku kültürü yoluyla istenilen bitkilerin çoğaltılmasının nasıl yapılabileceği konusunda ilgililere (evde hobi olarak veya ilköğretim okullarında) bazı bilgiler verilmektedir.

Burada amaç konu ile ilgili kişilerin normal olarak evde saksılarda veya bahçelerinde yetiştirdikleri, özellikle süs bitkilerinden, istedikleri anda ve kısa zamanda çok sayıda yetiştirebilmeleri için gerekli bilgileri sağlamaktır. Bu çalışmalar hem vakit geçirme hem de değişik bitkilerin üretimi ve çoğaltılmasında bilgi sahibi olmak açılarından faydalı olacaktır. Ayrıca ticari amaçlı süs bitkileri üretimi yapanlara da bazı hususlar bakımından ışık tutabilir. Son kısımlarda doku kültürü ile ilgili daha fazla teknik bilgi verilmiştir. Bu çalışmalar biraz daha fazla teknik bilgi, maliyet ve dikkat gerektirmektedir.

2. Doku kültürü için gerekli şartlar ve aletler

a) Dikkat edilecek en önemli husus temiz (steril) şartlarda bu işlemlerin yapılmasıdır. Bilimsel çalışmalarda genel olarak steril yatay hava akışlı kabin denilen bir ekipman kullanılır. Fakat ev şartlarında bir balık akvaryumu veya 50x40x40 cm ebatlarında silikonla izole edilmiş veya kenarlarından iyice yapıştırılmış, sadece bir cephesi açık cam bir kabin aynı işi görebilir,

b) Alet ve ekipmanları, besin ortamlarını, su, kağıt, havlu vb. diğer kullanılacak malzemeleri steril hale getirmek için basınçlı pişirici (30-40 cm çapında düdüklü tencere),

c) Bir litre ölçebilen ölçü kabı, yiyecek kabı ve kapaklı cam kavanozlar (100-200 ml reçel veya konserve kavanozları uygundur. Kapağı ile düdüklü tencerede ısıtıldığında ısıya dayanabilmelidir),

d) Keskin ağızlı bıçak (bisturi) ve pens,

e) Eczanelerden temin edilebilecek enjektör (1-5-10-25-50 ml) ve medikal malzeme satıcılarından elde edilebilecek 0.2 mikrometre delik çapında selüloz nitrattan yapılmış filtreler (Millipore). Bunlar ısı ile bozulabilen maddeleri içeren solüsyonların (örnek: Hindistan cevizi sütü, deniz yosunu özü, bitki ekstraktları vb.) sterilize edilmesinde kullanılacaktır. Kabin içinde steril enjektöre sıvı çekilir, ucuna steril bir filtre takılır ve yine steril kavanoz içine bastırılarak süzülür,

f) Alüminyum folyo ve 10x10 cm ebadında seramik fayanslar (3-4 adet). Bisturi, pens ve fayanslar folyo içine sarıldıktan sonra tencerede kaynatılarak sterilize edilir. Bitki parçalarını kesme işlemleri ise, folyo kabin içinde açıldıktan sonra fayans üzerinde yapılır,

g) Etil alkol içeren ispirto lambası (Metil alkol kullanmaktan sakının, zehirlidir).

h) %70’lik alkol solüsyonu (70 ml alkol 30 ml su ile karıştırılır) içeren sprey şişesi. Transfer kabinin içi ve diğer yüzeyleri temizlemek için kullanılır,

i) Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu için ticari olarak satılan çamaşır suyu (genellikle %50 sodyum hipoklorit içermektedirler ve %10 ‘luk solusyon hazırlamak için 20 ml çamaşır suyu 80 ml su ile karıştırılır),

j) Kauçuk eldivenler ve herhangi bir deri dezenfektanı (Eczanelerden temin edilebilir),

k) Besin ortamlarının hazırlanması için de aşağıdaki yolları izleyiniz.

3. Besin ortamlarının hazırlanması

Kullanılacak maddelerin çoğu eczane, market, kimyevi gübre veya medikal malzeme satıcılarından temin edilebilir. Aşağıdakiler yaklaşık 1 litre temel besin ortamını hazırlamada kullanılır:

1. İki su bardağı yağmur suyu veya saf su (kaynatılmış ve soğutulmuş su da olabilir),

2. Çeyrek su bardağı toz şeker (yaklaşık 30 g.),

3. Gübre stok solüsyonu (bir yemek kaşığı 20:20:20 NPK gübresi 2 litre suda eritilir ve buradan bir bardak dolusu solüsyon kullanılır),

4. Eczanelerden alınabilecek 500 mg’ lık inositol tabletlerinden yarım tablet ve Thiamin’li vitamin tabletlerinden ½ tablet (Multi-vitamin tabletleri de kullanılabilir),

5. Medikal malzeme satıcıların temin edilebilecek ve besin ortamını yarı-katı (jel) hale getiren agardan dört yemek kaşığı,

6. Ampisilin içeren antibiyotik tabletleri (250 mg)

7. Sitrik asit (sirke asidi) ve sodyum bikarbonat (Kabartma tozu)

Ağzı kapanabilen bir kaba önce su ve sonra bütün maddeler ilave edilerek karıştırılır. Besin ortamı pH’sı dar alalıkta renk değişimi ile pH’yı tahmin etmeye yarayan indikatör kağıtlarla ölçülür ve 5-6 arasına ayarlanır. Eğer pH fazlaysa sitrik asit, düşükse bikarbonat soda kullanılarak ayarlanmalıdır.

Daha sonra agar ilave edilerek eriyinceye kadar ocakta sık sık karıştırarak kaynatılır. Daha sonra eriyik kavanozlara ¼ (çeyrek) oranında veya 2 cm kalınlıkta doldurulur.

Basınçlı pişirici içine önce 1/5 oranında su, üzerine ayaklı bir sehpa (metal) konulur, sterilize edilecek malzemeler bu sehpa üzerine konulduktan sonra kavanoz kapakları gevşek olarak kapatılır ve tencerede buhar çıkmaya başlamasından itibaren 15 dakika süreyle tutulur.

Bitkileri çoğaltmak ve köklendirme ortamlarını hazırlamak için yukarıdaki ortama yarım bardak Hindistan cevizi sütü ve malt ilave edilir. Hindistan cevizi sütü yerine yarım bardak yeşil domates püresi veya yarım bardak taze sıkılmış portakal suyu da kullanılırsa ilginç ve farklı sonuçlar ortaya çıkabilir.

Ayrıca yarım çay bardağı organik deniz yosunu özü ilave edilebilir (Örnek: Kelpak).

4. Alet ve ekipmanların sterilizasyonu

Bistüri ve bıçaklar alüminyum folyo içine sarılarak basınçlı tencerede 15 dakika kaynatılarak steril hale getirilebilir. Bu aletler aynı zamanda ticari olarak satılan klor içeren bir çamaşır suyu içine batırılarak (15-20 dakika) veya alkol içine batırıldıktan sonra aleve tutularak (dikkatli olunuz!) da sterilize edilebilir.

Bitki materyallerinin durulanmasında steril su, çalışma yerinin silinmesinde steril bezler kullanılmalıdır. Çalışmaların tamamı kabin içine serilecek steril bir bez veya steril bir fayans üzerinde de yapılabilir. Su, cam şişe veya kavanozlar içinde, kağıt veya bezler ise bir kese kağıdı veya otoklav naylonu içinde yukarıdaki metodla steril hale getirilebilir. Kese kağıdı kullanılırsa, tencereden çıkardıktan sonra ıslak durumda olduğundan 80 0C ye ayarlanmış bir mini fırın içinde kurutulmalı ve kullanılıncaya kadar açılmamalıdır.

Doku kültüründe kullanılacak malzemelerin ve besin ortamlarının sterilizasyonunda kullanılan basınçlı pişirici veya filtre sterilizasyonuna alternatif bir diğer yöntem de mikrodalga sterilizasyonudur. Çünkü özellikle filtre sterilizasyonu pahalı ve az miktarda ortam için uygun olmakta, basınçlı pişirici veya otoklavda sterilizasyon ise uzun zaman almakta ve sterilize edilecek malzemelere zarar verebilmektedir. 700 W gücünde bir ev mikrodalga fırınını kullanarak 3 g şeker içeren 100 ml (%3) besin ortamının 5 dakikada, 250 ml ortamın 10 dakikada ve 1 litre ortamın da 15 dakikada başarıyla sterilize edilebileceği bildirilmektedir (Babaoğlu ve ark., 2001).

5. Bitki materyalinin sterilizasyonu

Bütün işlemler steril hale getirilmiş kabin içinde yapılmalıdır. Bütün bitki materyalleri sodyum hipoklorit veya kalsiyum hipoklorit solüsyon içinde sterilize edilebilir. Bir damla sıvı deterjan da ilave edilebilir. Bitki parçaları karışımda 10-20 dakika karıştırılarak tutulur, daha sonra kap boşaltılır ve steril su ile en az 3 defa durulanır. Bütün bu işlemler sırasında materyalin mikroorganizmalarca kirlenmemesi için çaba sarf edilmelidir.

Bunun için aşağıdaki konulara dikkat edilmelidir:

1. Şaçlar arkaya bağlanır. Elbise kolları arkaya sıvanır ve saat mücevher gibi takılar çıkartılır. Başlamadan önce eller iyice yıkanır, deri dezenfektanı ve koruyucusu ile muamele edilir. İstenilirse şeffaf eldivenler de takılabilir,

2. Kabin içi alkolle (en az %70’lik) spreylenir ve steril bir bez ile silinir,

3. Kullanılacak bütün malzemeler kabin içine veya yakın bir yere toplanır,

4. Sterilize edilmiş kaptan yine steril olan bir pensle (kesinlikle el değmeden) kullanılacak bitki gövdesinden bir parça alınır. Her iki işlem arası bu aletler alkole batırılır ve alev ile tekrar sterilize edilir. 2-3 cm uzunluğunda ve en az bir yaprağı bulunan parçalar kesilir ve gövde alt kısmı agar-besin ortamına batırılarak kültüre alınır. Eğer yapraklar çok geniş ve büyükse tamamen uzaklaştırılır veya bir kısmı kesilir. Her kavanoza bir tane parça konulmalıdır çünkü bu işlem kirlenme açısından önemlidir ve başarıyı artırır. Daha sonra kavanoz kapağı kapatılır ve oda sıcaklığında direkt güneş ışığı almayan bir yerde dört hafta boyunca kültüre alınır.

Bu süre içerisinde aşağıdaki gelişmelerden bir veya birkaçı ortaya çıkabilir:
a) Bazı sürgünler çamaşır suyunun etkisiyle ölebilir,
b) Bitkilerin salgıladığı toksinler (zehirler) gövdenin besin ortamına değdiği yerde bulunan dokuyu öldürebilir,
c) Bazı kavanozlarda bakteri veya mantarlar çoğalarak gövdeyi öldürür veya gelişimi zayıflatırlar,
d) Temiz olan kültürlerde yaprak koltuklarından yeni sürgünler hızla büyümeye başlarlar. Buradan sadece canlı ve temiz bitkicikleri içeren kavanozlar tutulup diğerlerinin basınçlı tencerede sterilize edilerek atılması ve hiçbir şekilde kaynatılmadan çöpe atılmaması gerekir.

Bitki büyüme düzenleyicileri (BBD) doku kültürü ortamlarının en önemli unsurudur. Bitkilerin büyüme ve gelişmesini artıranlar veya durduranları vardır. Tür ve çeşitlere göre değişmekle birlikte uygun olmayan konsantrasyonda ortama ilave edildiklerinde genellikle hiçbir etki ortaya çıkmaz.

Bitki hormonları, bir dokuda üretilip, büyüme ve gelişmenin olacağı diğer dokulara taşınan ve çok düşük konsantrasyonlarda etkili olan endojen organik bileşiklerdir. İndol asetik asit, zeatin, zeatin ribozid, GA, absisik asit ve etilen bitkilerce üretilen hormonlardandır. Sentetik yollarla üretilenler de dahil olmak üzere genel olarak hepsine bitki büyüme düzenleyicileri adı verilmektedir.

En çok kullanılanlar;
1) oksinler, 2) sitokininler, 3) gibberellinler, 4) absisik asit ve 5) etilendir. Etki tiplerine göre ise bitki büyüme düzenleyicileri Tablo 2'de gruplar halinde verilmiştir.

Oksinler;
Hücrelerin büyümesi be bölünmesinde, köklendirme, yan sürgünlerin gelişiminin engellenmesinde etkilidirler. Oksinler, doku kültürlerinde tek başına kullanıldıklarında kallus uyarımını, hücre süspansiyonlarının elde edilmesini ve somatik embriyo oluşumunun uyarımını, sitokininlerle birlikte kullanıldıklarında yine kallus oluşumunu, sürgün rejenerasyonunu (organogenesis) ve somatik embriyo oluşumunun uyarılmasını sağlayabilirler.

Ayrıca elde edilen sürgünlerin köklendirilmesinde vazgeçilmez bir kullanıma sahiptirler. Temel hormon formu IAA (indol-3-asetik asit)’tir.

Sentetik oksinler arasında NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T ve Pikloram sayılabilir. Sentetik oksinler ticari uygulamalarda meyve dökümünün engellenmesi ve çeliklerin köklendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

En çok kullanılan sitokininler adenin (aminopürin) türevleridir. Bunlar içinde de BAP en çok kullanılanıdır. Sitokininler, çoğunlukla kök ucu meristemi ve genç yapraklarda üretilir. Hücre bölünmesi, yeniden farklılaşma, bitki sürgün üretimi ve sürgün çoğaltımında etkili olup antioksidan etki göstererek yaşlanmayı da geciktirirler. Fakat sürgünlerde köklenmeyi ve embriyogenesisi engellerler.

Özellikle son yıllarda çok sık kullanılan ve güçlü bir sitokinin aktivitesi gösteren TDZ ve CPPU’nun doku kültürlerinde kullanımı ile ilgili bir çok çalışma mevcuttur. Fakat sentetik olarak elde edilen sitokinin benzeri bu iki maddenin kullanımı ile elde edilen sürgünlerin köklendirilmesi oldukça zor olmaktadır. Doğal sitokinin formları, zeatin ve zeatin riboziddir. Fakat bunlar daha pahalıdırlar.

Gibberellinler;
Meristemlerden bitki rejenerasyonunun uyarılmasında, sürgünlerin boylarının uzatılmasında, embriyo ve ovül kültürlerinde kullanılmaktadır. Kallus gelişimini, organogenesisi ve adventif kök oluşumunu engellerler. Ayrıca bitkilerde gövdenin uzamasını ve çiçeklenmeyi artırırlar. Doku kültürü yapmadan bile evde çiçeklenmeyi artırma ve boy uzamasını sağlamak için sprey halinde çiçeklere uygulanabilirler. Fazla dozda kullanılırsa çok fazla boy uzamasına neden olurlar. Dikkatli olunmalıdır.

Absisik asit;
strese maruz kalmış yapraklarda, uyuyan tomurcuklarda ve tohumlarda bulunur. Absisik asitin doku kültürlerindeki rolü henüz tam olarak anlaşılamamış olmakla birlikte halen somatik embriyoların olgunlaştırmasında kullanılmaktadır. Ayrıca yaprak ve meyve dökümü (absisyon) ve uyku halinde etkili olup, yaprak gözeneklerinin kapanmasını düzenlemesi diğer etkileri arasında sayılabilir. Absisik asit ışığa hassastır.

Bu tür maddeler medikal malzeme satanlarca temin edilebilir. Fakat çoğu suda erimediğinden alkol veya sodyum hidroksit veya potasyum hidroksit içinde eritilebilirler. Bu nedenle evlerde veya okullarda kullanımlarında sorunlar çıkabilir ve bunun yerine doğal hormonları içeren deniz yosunu özlerinin (örnek: Kelpak) kullanımı tavsiye edilir. Konuya daha fazla ilgi duyanlar Tablo 3’te verildiği şekilde büyüme düzenleyicilerini kullanabilirler.

6. Sürgünlerin çoğaltılması

Dört haftadan bu ana kadar yeni sürgünler uzamış durumdadır. Bu sürgünler Hindistan cevizi sütü içeren besin ortamına transfer edilmelidir. Aynı şekilde sıvı deniz yosunu özü de (Özellikle Ecklonia maxima’dan elde edilen) bu amaçla kullanılabilir. Her iki madde de hücre bölünmesini ve büyümesini teşvik eden tabi formda oksin ve sitokinin içerir. Besin ortamına transfer edilen sürgünler kısa sürede (1-2 hafta) çok sayıda yeni sürgün üretirler. Bu yolla istenildiği kadar yeni sürgün elde edilebilir.

Bunları yapmak için:

1. Daha önce yapılan ortam hazırlama, alet ve ekipmanları temizleme gibi işlemler tekrar yapılır. Eller de yıkanır.

2. Sürgünleri ihtiva eden kavanozlar kabinin bir tarafına, ortam ve diğer gereçler de diğer tarafına koyulur.

3. Bir pens ile bitkiler kavanozlardan çıkarılır ve steril fayans veya ıslak bez üzerinde sürgünler ayrılır ve taze besin ortamı içeren kavanozlara 3-4’er tane transfer edilir ve daha önce bildirildiği şekilde kültüre alınır. Bu çoğaltma işlemi 3-4 haftada bir tekrarlanır. Genel olarak sürgünler her 4 haftada 3-4 kat büyüyebilirler. Bu devrede görülen kirlenme ve mikroorganizmaların çoğalması çoğunlukla kötü izolasyon şartlarından dolayıdır. Bu yolla istenildiği kadar bitki çoğaltılabilir. Eğer çalışılan türde sürgün çoğaltımı sağlanamıyorsa Tablo 3’te verilen büyüme düzenleyicilerinden BAP, Kinetin 1-2 mg/l konsantrasyonda kullanılabilir.

Tablo 2. Uygulama alanları ve etki şekillerine göre bitki büyüme düzenleyici, engelleyici ve hormon grupları.

Oksinler: 4-CPA (p-CPA), 2,4-D, 2,4-DB, 2,4-DEP, 2,4,5-T, IAA, IBA, naftalenasetamid, α-naftalenasetik asit (NAA), 1-naftol, naftoksiasetik asit (NAO), potasyum naftenat, sodium naftenat, dikloroprop, fenoprop, sodium naftenat

Sitokininler: 2iP, benzil amino pürin (BAP), kinetin, zeatin, CPPU

Gibberellinler: Gibberellin, gibberellik asit

Anti-oksinler: Klofibrik asit, TIBA

Büyüme uyarıcılar: Brasinolid, himeksazol

Büyüme engelleyiciler: Absisik asit, ansimidol, butralin, karbaril, klorofonyum, klorprofam, flumetralin, fluoridamid, fosamin, glifosin, izopirimol, jasmonik asit, maleik hidrazit, mepiquat

Büyüme gerileticiler: Kloromequat, daminozid, flurprimidol, paclobutrazol, tetsiklasis, unikonazol

Morfaktins: Klorfluren, klorflurenol, dikloroflurenol, flurenol

Defolyantlar: Kalsiyum siyanamit, dimethipin, endotal, etefon, metokzuron, pentaklorofenol, thidiazuron (TDZ), tribufos

Etilen salgılayıcılar: ACC, AVG, etefon

Diğer sınıflandırılamayan bitki büyüme düzenleyicileri: Benzofluor, buminafos, karvon, siyobutit, siklokeksimid, etiklozat, fenridazon, forklorofenuron, karetazan, metasülfokarb, sintofen, tripentenol


7. Köklendirme

Yeterli sayıda sürgün elde edildiğinde bu sürgünler en az 2 cm kadar boylandıktan sonra köklendirme işlemine başlanır. Sürgünler Hindistan cevizi sütü, malt veya deniz yosunu özü ilave edilmiş besin ortamı içeren kavanozlara (4-5 tane/kavanoz) transfer edilir ve sürgün oluşumu şartlarında kültüre alınır.

2-4 hafta arasında köklerin çıkmaya başlaması gerekir. Aksi taktirde besin ortamı, temizlik veya ışık şartları gibi nedenlerden dolayı bazı problemler var demektir. Bunu aşmak için deniz yosunu özü miktarı artırılabilir (iki tatlı kaşığı), besin ortamının pH kontrolü iyi yapılır, kavanozlar belirli bir süre karanlıkta (alüminyum folyo ile sarılarak, 1 hafta) kültüre alınabilir. Ayrıca bazı bitki türleri sadece temel besin ortamı içeren ortamlarda köklenebilirler. Bu nedenle her iki ortam da test edilmelidir. Köklendirme sağlanamazsa Tablo 3’te verilen IBA ve NAA gibi büyüme düzenleyicileri 1 mg/l konsantrasyonda kullanılabilir.

Köklenme sonrası hemen ortamdan bitkiler uzaklaştırılmalıdır. Köklendirme için steril kum içeren kavanozlar da kullanılabilir. Kum içinde köklendirme çoğu kez başarılı sonuçlar vermiştir.

8. Köklendirilmiş sürgünlerin saksılara transferi

Bu noktadan itibaren aşağıda belirtilen bütün işlemler açıkta, garaj, mutfak tezgahı veya masada yapılabilir. Dikkat edilmesi gereken kavanozlardan çıkartılan bitkilerin hemen saksılara alınması ve üzerlerinin plastik poşetlerle kapatılmasıdır. Açıkta fazla bekletilen köklü sürgünler kavanoz içinde çok nemli ortama alıştıkları için hemen solup canlılıklarını kaybederler.

1. Saksılar torf (pit), kompost veya bunların her birinin perlit veya kum ile yarı yarıya (%50) karışımı ile fazla bastırmadan doldurulur ve saksı kenarlardan tutularak hafifçe masaya vurularak karışım saksıya iyice yerleştirilir. Saksılar iyice sulanır ve suyun aşağıdan akması beklenir.

2. Kavanozlardan agar ortamında köklenmiş sürgünler (köklü bitkiler) pensle çekilerek çıkarılır ve soğuk olmayan su ile kökleri iyice yıkanır,

3. Bir kalem, çubuk veya parmakla saksının ortasına bir delik açılır ve bitki yavaşça içine konulup kenarlardan hafifçe bastırılarak dibi kapatılır.

4. Yaprakların üstüne bir sprey ile su püskürtülür. Bu saksıların üzeri direk güneş ışığı görmeyen bir yerde üstü plastik şeffaf bir örtü veya kapla örtülür. Bu örtü bitkilerin kurumasını önlemek amacıyla kademeli olarak kaldırılır. Alternatif olarak saksının boyuna uygun olan naylon bir poşet saksı üstüne geçirilir ve saksı ikinci bir saksı içine yerleştirilir. Bu işlem naylon poşetin çıkmasını önleyecektir. Bir hafta sonra makasla poşetin bir köşesi, ondan sonraki hafta diğer köşesi kesilir. Üçüncü hafta poşet tamamen kaldırılabilir ve bitkiler artık normal oda sıcaklığına alışmış demektir. Bu noktadan itibaren artık saksılara gübre verilebilir ve bitkiler normal bir bitki gibi muamele edilir.

Yukarıda belirtilen sistemler ayrıca okullarda da (özellikle lise ve dengi) uygulanabilir. Sistemin maliyeti ucuzdur ve pahalı araç, gereç ve kimyasallara ihtiyaç göstermez.

Bütün bunlara ek olarak daha gelişmiş ve biraz daha maliyetli bir sistem için medikal malzeme satıcılarından aşağıdaki imkanlar da temin edilebilir:

1. Mikro dalga fırın: Besin ortamları ve malzemeler daha kolay bir şekilde sterilize edilebilir,

2. Toz halde hazır besin ortamları. Örnek: MS (1) veya B5 (2) besin ortamı. Ambalaj üzerinde bir litre besin ortamı için ne kadar kullanılması gerektiği yazılıdır, bütün besin elementlerinin karışımı olarak toz haldedirler, sadece şeker, agar ve gerekiyorsa bitki büyüme düzenleyicileri ilave edilir,

3. BAP (Benzilaminopurin) ve NAA (Naphtalene asetik asit) stok solüsyonu (BAP sentetik bir sitokinindir ve sürgün çoğaltılmasında kullanılır, NAA ise bir oksindir ve hücre bölünmesi ile köklenmede etkilidir). Solüsyon olarak bulunamazsa toz olarak alınır ve buradan 100 mg (0.1 g) tartılır birkaç damla 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ile eritilir ve kalanı su ile doldurularak 1 litreye tamamlanır. Bu şekilde bir ml’de 0.1 mg büyüme düzenleyicisi ihtiva eden bir stok solüsyon hazırlanmış olur. Bu solüsyondan bitkilerin çoğaltılması için sterilizasyondan önce hassas enjektörle bir litre besin ortamına değişik oranlarda ilave edilebilirler. Örnek: 2 mg/l son konsantrasyon için 20 ml ilave edilir,

4. Sakaroz: Bitki hücrelerinin enerji ihtiyacını karşılayan pancar veya kamış şekeridir ve genelde bir litre için 30 g kullanılır. Saf olarak satılanlar daha iyi sonuç verirler,

5. Agar: Deniz yosunlarından ekstre edilen bir maddedir. Besin ortamın yarı-katı (jel) haline getirir, bitkilerin tutunmasını sağlar ve bir litre için genelde 7-8 g kullanılır,

6. 1-2 ml: (1/10 ml veya 100 mikrolitre bölmeli) ve 5-10 ml steril hassas enjektörler.

9. Önemli notlar, tanımlamalar ve kullanılan birimlerin açıklaması

a) pH: Besin ortamının asitlik veya baziklik durumunu gösterir. Bitki hücre ve doku kültürleri için en uygun pH aralığı 5.5-6.0 arasındadır. pH çok düşük olursa (3.0-4.0) agar katılaşmaz. Bu nedenle mutlaka iyi ayarlanmalıdır.

b) Doku kültürü yapılacak bitki materyallerinin tohumları varsa, bunları önce steril hale getirip, steril besin ortamlarında fidelerinin elde edilmesi ve bu temiz fideleri kullanarak çoğaltma yapmak daha pratiktir. Çünkü yeşil bitki materyallerinin sterilizasyonu zordur. Bu işlemler sırasında plastik eldiven giymek kirlenme şansını azaltır. Kültürlerin veya kabinin içine nefes alıp vermekten kaçınılmalıdır.

c) Solüsyon hazırlanması
Kullanılacak madde sıvı ise,
Örnek 1: %50’lik solüsyon: 50 ml+50 ml su= 100 ml %50'lik solüsyon.
Örnek 2. %70'lik alkol solüsyonu hazırlamak için 70 ml etil alkol+30 ml su=100 ml %70'lik alkol solüsyonu elde edilir.
Katı ise; Örnek %3'lük sakkaroz (şeker) çözeltisi: 30 g şeker bir kapta eritilir ve 1 litreye tamamlanarak %3'lük 1 litre şeker çözeltisi elde edilir.

d) Kullanılan birimler
1 L= 1000 ml veya 1000 cc (1 ml= 1 cc olarak alınmıştır).
100 ml= 0.1 L (litre)
1 kg= 1000 g (gram)
1 g= 1000 mg (miligram)
1 mg= 1000 mikrogram

e) Doku kültüründe en fazla kullanılan ve besin ortamını oluşturan komponentler şunlardır:

1. Organik olanlar: Sakaroz (hücrelere enerji sağlar), İnositol (basit alkol şekeri), hormonlar ve bitki büyüme düzenleyicileri (büyüme ve gelişmeyi kontrol ederler), vitaminler (büyüme ve gelişmede önemlidirler) ve agar (nötr bir maddedir).

2. İnorganik olanlar: N(=Azot: Yaprak gelişimi, klorofil, amino asitler ve protein yapımında), P (=Fosfor: Meristem ve DNA yapımında), K (=Potasyum: Hücre bölünmesi ve kök oluşumunda), S (=Kükürt: kök gelişiminde), Ca (=Kalsiyum: Hücre duvarı yapımında), Mg (=Magnezyum: Klorofil molekülünün yapımında), Fe (=Demir: Klorofil oluşumunda), B (=Bor: Bitkide şeker dolaşımında), Mo (=Molibden: Azot fiksasyonunda), Mn (=Mangan), Cu (=Bakır) ve Zn (=Çinko) çeşitli enzim aktivitelerinde kullanılırlar.

3. Su: Saf su olmalıdır. Besin ortamının en önemli parçasıdır.

Daha fazla bilgi için Bitki Biyoteknolojisi kitaplarından faydalanabilir veya mbabaogl@selcuk.edu.tr adresine mesaj gönderebilirsiniz.


Kaynaklar

1. Babaoğlu M, Yorgancılar M, Akbudak MA (2001). Doku Kültürü: Temel Laboratuar Teknikleri. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I Doku Kültürü ve Uygulamaları (M. Babaoğlu, E. Gürel, S. Özcan Editörler) s. 1-35, S.Ü. Vakfı Yayınları, Konya.
2. Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497.
3. Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968). Nutrition requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exper. Cell Res. 50:151-159.

4. Stiff C.M. (1998) Plant tissue culture for the classroom and home: A manual to accompany the ‘Kitchen Culture Kit’. Kitchen Culture Kits Inc. USA.

Tablo 3. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan bitki büyüme düzenleyicileri (Babaoğlu ve ark., 2001)
Adı Kısa Adı Mol. Ağırlığı Erime durumu Toz halde saklama sıcaklığı (0C) Stok solüsyon saklama sıcaklığı (0C) Etkili Kons. aralığı (mg/l) Otoklav (O)-Filtre (F) ile Sterilizasyon
Oksinler
2,4,5-Triklorofenoksi asetik asit 2,4,5-T 255.5 EtOH OS* 0-5 0.01-5 O
2,4-Diklorofenoksi asetik asit 2,4-D 221.0 EtOH OS 0-5 0.01-5 O
İndol-3-asetik asit IAA 175.2 EtOH -0 -0 0.01-3 O/F
İndol-3-butirik asit IBA 203.2 EtOH 0-5 -0 0.1-10 O/F
İndol-3-propiyonik asit IPA 189.2 NaOH -0 -0 0.1-10 O/F
Naftalen asetik asit NAA 186.2 NaOH OS 0-5 0.1-10 O
Naftiloksi asetik asit NOA 202.2 NaOH OS 0-5 0.1-10 O
p-klorofenoksi asetik asit 4-CPA 186.6 EtOH OS 0-5 0.1-10 O
Fenil asetik asit PAA 136.2 EtOH OS 0-5 0.1-50 O/F
4-amino-3,5,6-trikloro pikolinik asit Picloram 241.5 DMSO OS 0-5 0.01-10 O
Sitokininler
Adenin sülfat 184.2 Su OS 0-5 50-250 O
6-Benzil amino pürin BAP 225.3 NaOH OS 0-5 0.1-5.0 O
N-(2-Choloro-4-pyridyl)-N”-Fenil üre CPPU 247.7 DMSO 0-5 0-5 0.001-1.0 F
İzopentil adenin 2IP 203.2 NaOH -0 -0 1.0-30.0 O/F
Kinetin K 215.2 NaOH -0 -0 0.1-5.0 O/F
1-Fenil-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) üre Thidiazuran (TDZ) 220.2 DMSO, KOH OS 0-5 0.001-0.05 O/F
Adenin sülfat 368.34 HCl OS 0-5 50-250 O
Zeatin ZEA 219.25 NaOH -0 -0 0.1-5.0 F
Zeatin ribozid ZR 363.4 NaOH -0 -0 0.05-5.0 F
Gibberellik asit GA3 346.4 Su 0-5 -0 0.05-5.0 F
Absisik asit ABA 264 Su 0-5 -0 0.1-5.0 F
*EtOH; Etil alkol, NaOH: Sodyum hidroksit, DMSO: Dimetilsülfoksit, HCl: Hidroklorik asit, KOH: Potasyum hidroksit, OS: Oda sıcaklığı.
Not: Bütün stok solüsyonlarda, özellikle filtre ile sterilize edilenlerde, pH dikkatli bir şekilde 5.0’e ayarlanmalıdır.


Doç. Dr. Mehmet Babaoğlu
Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi, 42079 Kampüs, Konya
Tel-Fax: 0332 2513564
mbabaogl@selcuk.edu.tr