Bu
Bacillus türleri muhteşem. Aşağıdaki makale herkes tarafından sabırla okunmalı bence. Çünkü birileri bu literatüreri tarayıp, buralardan aşırma yaparak ürünlerine olmadık marifetler yükleyebiliyorlar.
KİTİNAZ ÜRETEN BACILLUS İZOLASYONU, ENZİMİN KISMİ SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU
Enzimler, canlı hücreler tarafından biyolojik koşullarda sentez edilmelerine rağmen, aktivite göstermeleri için hücre içinde bulunmaları gerekmez. Enzimler çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere günlük ve ekonomik hayatta önemli düzeyde kullanılmaktadırlar. Ekonomik sahalarda; ekmek, bira ve peynir üretimi gibi, günlük yaşamda, temizlik alanlarında, ayrıca tıpta teşhis ve tedavide önemli rol oynamaktadırlar. Kimya endüstrisinde, gıda proseslerinde, ziraatta ve hatta biyolojik savaşta da pek çok kullanım alanları bulunmaktadır.
Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genelde mikroorganizmalardan elde edilirler. Çünkü mikrobiyal enzimler; bitkisel ve hayvansal ayrıca kimyasal olarak üretilen enzimlere göre önemli avantajlara sahiptirler. Katalitik aktiviteleri çok yüksektir, istenmeyen yan ürünler oluşmaz, daha stabil ve ucuzdur, ayrıca bir üretim prosesinde çok fazla miktarda üretmek mümkündür. Mikroorganizmalar üremeleri, metabolizmaları ve otoliz olaylarının gerçekleşmesi için pek çok enzimi sentezler. Bu enzimlerin çoğu hücrenin içinde çevreden korunmuş olarak iş görmektedir. Fakat bazıları hücrenin dışına salgılanarak etkinliğini gösterebilir, bunlara ekstrasellüler enzimler denir. Ekstrasellüler enzimler, ortamda bulunan yüksek molekül ağırlıklı besin maddelerini hidroliz ederek mikroorganizma tarafından alınabilir forma dönüştürürler. Bu enzimlere genel olarak hidrolazlar denir. Ekstrasellüler enzimler mikroorganizmanın ürediği/üretildiği ortama salındığı için, ortamın fiziksel ve kimyasal özelliklerine karşı kendisini stabil kılan bazı özelliklere sahip olması gerekir.
Mikroorganizma için gerekli, ise fazla miktarda üretilebilir, söz konusu enzimin substratı ortamda bulunursa enzim üretimi indüklenebilir. Bu özelliği sayesinde, ektsrasellüler enzimler endüstriyel alanlarda kullanılmak için uygun ve vazgeçilmez moleküller haline gelmiştir. Günümüzde mikrobiyal enzimlerin pek çoğu önemli araştırma konusu haline gelmiş, dünyanın hemen her yerinde üretilmeye, sanayi, endüstri alanında kullanılmaya başlanmıştır. Endüstri alanında kullanılan pek çok mikrobiyal enzimin
Bacillus cinsine ait türler tarafından sentezlendiği bilinmektedir.
Kitin ve Kitinazlar
Kitin polimerleri böceklerin dış iskelet yapılarında, Crustacea’ların kabuklarında, birçok mantar ve olgun hücre duvarında ve nematodlarda yapısal element olarak bulunan ve N-asetil glukozamin rezidülerinin β,1-4 bağlanması ile oluşmuş bir polisakkarit olup en çok görülen doğal polimerlerdendir.
Kitin formları uzun düz zincirler ihtiva eden yapılardır. Bu sebepten selüloza benzer bir özellik gösterir, fakat yapısında selülozdan farklı olarak hidroksil grupları yerine asetilasyona uğramış amino gruplar bulundurmaktadır. Kitosan yine kabuklularda bulunur. Kitin ve kitosan, kalsiyumu bağlar ve proteinlerle kovalent bağlar oluştururlar. Proteinler diğer karbonhidratlar için bağlayıcı görev yapar. Bu kopolimer eğer %7 den daha az azot ihtiva ediyorsa kitin olarak tanımlanır. Mucor rouxii’den elde edilen kitin deaçilaz (deacylase), kitinin, kitosan ve asetik asite hidrolizini katalizler. Çözünebilir kitosanın moleküler ağırlığı yüzbinlerce hatta iki milyon dalton kadar olabilir.
Kitinazlar organizmalar arasında oldukça yoğun bir dağılım gösterir. Bu dağılım bakteriler, mantarlar, yüksek bitkiler, böcekler, kabuklular ve bazı omurgalıları içermektedir. Kitinazların bu organizmalardaki rolleri çok çeşitlilik gösterir.
Örneğimn; mantar, kabuklu ve böceklerde organizmanın modifikasyonunu sağlar. Bitkiler, mantarlara karşı savunma mekanizması olarak kitinaz üretirler.
Kitinaz, fungal patojenlerin misellerini parçalar. Kitinaz geninin bitkilere transferi ile elde edilen transgenik bitkiler fungisid ve insektisid özellikler kazanmakta ve böylece transgenik bitkiler kendileri için patojen funguslarla ve böceklerle savaşabilmektedir.
Doğal olarak genotipinde kitinaz geni bulunduran bazı bitkiler bilinmektedir. Örneğin;
akçaağaç, siyah, kırmızı ve beyaz meşe ağaçlarının sağlıklı gövde ve kök dokularında β-1,3-glukanaz ve kitinaz varlığı tespit edilmiş ve bu enzimlerin bu ağaçlarda patojen olan
Armillaria mellea’nin hif çeperlerinin erimesine sebep olduğu bildirilmiştir.
Sağlam ve sert bir madde olarak böceklerin ve salyangoz gibi yumuşak canlıların dış iskeletini oluşturur. Her sene pek çok deniz canlısının evi ve sığınağı olan bu kabukların trilyonlarcası içlerindeki canlının ölmesi sonucu okyanus ve deniz diplerine dolmaktadır. Bu ortamlardaki kitin parçalayıcı organizmalar sayesinde, önemli bir biyolojik arıtım olmaktadır. Özellikle
Vibrio furnisii olarak isimlendirilen bakteriler deniz ve okyanuslarda en önemli kitin parçalayıcı bakteriler olarak görev yapmaktadırlar. Bu bakterilerin üretmiş olduğu kitinaz bir dizi kimyasal işlemden sonra, kitini glikoz ve amonyak haline dönüştürürler. Kitinazlar yüksek organizasyonlu bitkiler ve mikroorganizmalar tarafından sentezlenmektedir.
Bu enzim; domates, soya fasülyesi, buğday kepeği gibi bitkilerden izole edilmiştir ve Streptomyces (özellikle S. griseus) erratia ve Aeromonas türleri potansiyel üreticileridir. Kitinaz diğer karbohidrazlara benzer şekilde 3 enzim kompleksi ihtiva eder; bunlar;
endokitinaz, ekzokitinaz ve kitobiazdır.
Ticari kitosanazlar fermentasyon yoluyla
Bacillus pumilis’ten (Chitosanase BP [MJ]) üretilmiştir. Bu enzim glükozamin polimerlerini içeren mikroorganizmaların duvarını parçalama yeteneğindedir (mantarlar kitin duvar içerir).
Bakteriler tarafından üretilen kitinaz ise, kitini karbon (C) ve enerji kaynağı olarak kullanma amacına yöneliktir. Endokitinazlar, ekzokitinazlar, beta-N-Asetilglükoaminidazlar ve kitobiazlar olarak sınıflandırılan kitinazların, kitin ve onun türevlerini parçaladıkları bilinmektedir. Endokitinazlar kitin polimerini içten parçalayarak ekzokitinazlar da kitobiozu bir uçtan salıvererek işlev görürler. Beta-Nasetil glikozaminidaz N-asetil glikoz amin monomerlerini kitinden çıkarır bu durumda kitobiaz da kitobiozu N-asetil glikozamine hidroliz eder. Kitinazlar birçok mikrobiyal türlerin bünyesinde barınmaktadır.
Serratia, Bacillus, Vibrio türlerinin birçok kitinolitik enzim salgıladıkları ve kitin bağlayan protein ihtiva ederek bunların kitini sinerjitik olarak parçaladığı ve eksraselüler çevreye salgıladıkları bilinmektedir.
Bacillus türleri arasında kitinaz ve kitobiaz dağılımı incelenmiş ve
Bacillus licheniformis 2X-70 suşunda termostabil kitinaz aktivitesi olduğunu saptamıştır.
Bacillus circulans yaban tipi(wild type) 12 suşu kültür besi yeri içine kitinazı salgılama yeteneğindedir. Bakteri içerisinde teşvik edici subsrat olarak kitin ihtiva eden besi yerinde üretildiği zaman, 6 ayrı kitinaz enzimini salgılamakta ve enzim kültürün süpernatantından elde edilebilmektedir. Kitinaz A-1’in kitine karşı yüksek düzeyde affinitesi olduğu ve kitinaz sistemi içerisinde kitinazı parçalaması açısından önemli olduğu düşünülmektedir.
Bacillus circulans 4.1 suşunun kitini yüksek pH’da (6-12.0) parçaladığı ve bu organizmadan kitinazın kısım kısım saflaştırılarak elde edildiği ve elde edilen kitinazın da güve larvaları üzerine toksik etkili olduğu saptanmıştır.
Bacillus thuringiensis’in böcekler üzerindeki toksisitesi kitinaz kodlayan gen tarafından artırılabilir.
Bacillus
Bacillus türü, aerob, sporlu çubuklar ailesinde bulunurlar ve genelde gram pozitif boyanırlar. Vejetatif formları düz, kenarları birbirine paralel, ucu yuvarlak veya künt biten, 0.5-1.2 μm eninde 2.5-10 μm boyunda basillerdir. Tek tek veya uzun zincirler şeklinde görülürler. Türlerinin hepsi ısıya dayanıklı spor üretme yeteneğindedirler. Sporları silindirik, elipsoidal, küresel olabilir ve santral, subterminal veya terminal konumda bulunurlar.
Bacillus anthracis dışındakilerin hepsi saprofitik ve genellikle patojenik değildir.
Tipik olarak aerobiktirler fakat bazıları fakültatiftir. Mezofilik cinsler çoğunlukta olsa da zorunlu termofil, psikrofil, asidofil ve halofil cinslerde bulunur. Türlerin çoğunda hareket peritrik kamçılar tarafından sağlanır.
Doğal ortamlardan (özellikle kitin ihtiva eden çevrelerden), kitinaz üretme yeteneğinde olan mikroorganizmaların
(Bacillus türleri) izolasyonu, saf kültürlerinin hazırlanması, identifikasyonu, en yüksek kitinaz üretme yeteneğinde olan suştan üretilecek kitinaz enziminin karakterizasyonu amaçlanmıştır. Enzim karakterizasyonu için; optimum pH, optimum sıcaklık, pH ve sıcaklık stabilite tayinleri, SDS-PAGE’de enzimin separasyonu, çeşitli inhibitör ve aktivatörlerin enzim aktivitesi üzerine olan etkileri araştırılacaktır.
Materyal
Bu araştırmada kullanılan
Bacillus suşları doğal ortamlardan izole edilmiştir. Besiyerleri, çeşitli tamponlar, kimyasallar, shaker, santrifüj, spektrofotometre, elektroforez sistemleri ve diğer ekipmanlar kullanılmıştır.
Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu
İskenderun Körfezi’nden alınan yengeçler (8 adet) Çukurova Üniversitesi kampus toprağı (1 kg) ve kompost (500 g) ile karıştırılmış ve açık havada 1 ay bekletilmiştir.
Hazırlanan örnekleme karışımına 3 L distile su eklenerek karıştırılmış, 2 saatlik dinlendirmeden sonra üst kısımdan 10 mL örnek alınarak 85 °C’de 10 dakika ön işleme tabii tutulmuştur.
Ön işlemi takiben, LB (Luria-Bertoni Broth) besiyerine 2 mL örnek inoküle edilmiş, shakerda (2500 d/dk) 24 saat süreyle 37 ºC’de inkübasyona bırakılmıştır.
Elde edilen kültürden, seri sulandırma (10-6-10-7) yapılarak N1 Agara tek koloni düşecek şekilde yayma metoduyla ekim yapılmış, 37 °C’ de 1 gece inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda tek düşen koloniler (550 adet), kitinli besiyerinde üretilerek sonraki çalışmalar için saklanmıştır (stok kültür şeklinde).
Kitinaz aktivitesi gösteren (kitinaz pozitif) suşlar; ısısal işleme tabii tutulduktan sonra üreyebilmeleri, spor boyama metodu ile mikroskopta spor formlarının gözlenmesi sonucu
Bacillus sp. olarak tanılanmış ve bu doğrultuda çeşitli biyokimyasal testler yapılmıştır. Tanılama amacıyla morfolojik ve biyokimyasal parametrelerin yanında, en yüksek kitinaz aktivitesi gösteren HBK-51 suşu; yağ asiti analizleri ve 16S RNA/DNA dizi analizlerine göre tanılanmıştır.