agaclar.net - View Single Post

acemi_caylak · 26-08-2010, 22:23

Doç. Dr. A. Kadir Halkman'ın Tarım Mikrobiyolojisi kitabında, B. thuringiensis' in (forumda bilinen adıyla Delfin WG) biyoinsektisit olarak üretilmesi ayrıntılı olarak var. Buraya da aktarıyorum. Melas, buğday unu, soya unu vb. yöntemler bu konunun okuyucularına hiçte yabancı değil. Ki bir çok bakteri fermentasyon yöntemi ile üretiliyor. Önemli olan bunların bulundukları ortamları bilmek ve buradan alınan örneklerden izole edebilmek.

Zararlı böceklerin kontrolünde Bacillus cinsinden bakteriler kullanılmaktadır. Bu alanda kullanılan bakterilerin sporlu olmaları dikkat çekicidir. Sporlu bakterilerin kolayca ve büyük miktarlarda üretilebilmeleri, ticari amaçla kullanılmalarının başlıca nedenidir. Buna karşın spor oluşturmayan, oysa büyük miktarlarda üretilebilen hiç bir sporsuz bakeri ticari amaçla kullanılammıştır. Bu durum, muhtemelen, sporsuz bakerilerin pratikte kolayca stabilize edilememelerinden doğmaktadır.

Biyolojik İnsektisitlerin Üretimi

Entomopatojenler ya fermentasyon yolu ile (in vitro) ya da yaşayan böcekler üzerinde (in vivo) üretilirler. Derin veya yüzey fermentasyon yöntemleri fakültatif entomopatojenler (bakteri ve mantarlar) için, in vivo yöntemler ise, zorunlu entomopatojenler (virüs ve protozoonlar) için uygulanır. Örneğin B. thuringiensis ve B. moritai bakterilerinin ticari üretimi için genellikle derin fermentasyon yöntemi seçilir, yüzey fermentasyonu ise B. bassiana ve Hirsutella thompsoni gibi funguslar için kullanılır. In vivo yöntemler sadece böcek virüsleri ve protozoonlar için kullanılıyorsa da bazı istisnalar da vardır. Örneğin B. popilliae bakterisinin sporlarından oluşan ve piyasada “Doom” adı ile bilinen insektisit canlı böcek larvalarından üretilebilmektedir.

Yöntem ne olursa olsun, ilk olarak böcek patojeni olan mikroorganizma bol miktarda üretilir, cam şişelere dağıtılarak liyofilize (dondurarak kurutma) edilir. Üretim için daima bu referans suşlar kullanılır. Bakteriyel entomopatojenler elde edilirken bu şişelerdeki liyofize kültürden eğri besiyerlerine ekim yapılır ve bunlar başlangıç inokülümü (başlangıç kültürü, aşı) olarak kullanılır. Yüzey ve derin fermentasyon yöntemlerinde başlangıç inokülümünden önceki aşamalar aynıdır. Ancak üretim ve ürünü elde etme işlemlerinde önemli farklar vardır.

Fermentasyon için çeşitli karbon (melas, glikoz, tahıl ezmesi ,tahıl ürünleri) ve azot (pamuk tohumu, balık, soya fasulyesi, maya, kazein hidrolizatı) kaynakları kullanılır. Gerekiyorsa ana mineraller ve üreme faktörleri de ilave edilir.

Fermentasyon sonunda oluşan ürün santrifüjde çevirme, filtrasyon, presipitasyon (dibe çöktürme) veya püskürterek kurutma gibi işlemlerden biri veya bu işlemlerin bir kombinasyonu ile elde edilir. Fermentasyon tipine, yöntemin ekonomik oluşuna veya spesifik formülasyon gereksinimine bağlı kalınarak, uçucu sıvı, suda eriyebilen pudra, toz veya granüler ürün haline getirilir, aktivite tayini yapılarak piyasaya verilir.

Entomopatojenlerin in vivo olarak üretilmesinde ilk kez tırtıl larvaları kullanılmıştır. Bugün ise tırtıl larvalarının yanısıra, güve, pamuk kurdu ve sivrisinek larvalarından yararlanılmaktadır. Larvaların üretimi için belirli loşulların sağlandığı insektoryumlar ve özel bir diyet hazırlanır. İnsektoryumlarda hastalıksız ve standart olarak elde edilen larvaların %95’i üretilecek entomopatojen virüs (veya protozoon) ile infekte (bulaştırma) edilir, kalanı ise böcek kültürünün devamlılığını sağlamak üzere muhafaza edilir. Entomopatojen tarafından öldürülen larva hücrelerinden bir emme tüpü vasıtası ile mikroorganizmalar toplanır ve ticari preparasyonlar haline getirilir.

Bacillus thuringiensis

B. thuringiensis’in yaygın olarak kullanıldığı yerler yonca, enginar, pamuk, fasulye, lahana, karnabahar, kereviz, salatalık, marul, kavun, patates, ıspanak, tütün, tatlı mısır gibi tarla ve bahçe bitkileri, portakal, elma, üzüm, limon, zeytin gibi meyveler ile orman ağaçları ve süs bitkilerindeki çeşitli böceklerdir. Bunların dışında bal arısı kovanlarında görülen büyük mum güvesine karşıda kullanılmaktadır.

B. thuringiensis grubu bakteriler aerobik (oksijenli solunum), hareketli, çubuk şeklinde gram ve katalaz pozitif, endospor oluşturan, fermentatif, mikroaerofilik (çok düşük oksijen düzeyinde solunum yapabilen) ve anaerobik (oksijensiz) üreme yeteneğine sahiptir. Bunlar aerobik koşullarda spor meydana getirmekteir. Taksonomik olarak (canlıların sınflandırılması) Bacillus cereus ile yakından ilişkilidir. Ancak B. thuringiensis serotipleri spor oluşum aşamasında delta toksin veya parasporal kristalin bulunuşu ile karakterize edilmektedir. Bu yapı diğer hücre metaryelleri gibi boyanmakta, eksosporium oluştuğunda serbest halde görülmekte, sporlardan kolaylıkla ayrılmaktadır.

B. thuringiensis’in tanıları ise parasporal kristal oluşmundan başka diğer toksinlerin üretimine, esteraz tiplerine, vegetatif hücrenin flagella antijenlerine göre yapılmaktadır.

Endüstriyel Üretim

1- İzolasyon

Hedef zararlıya karşı etkili entomopatojenin izolasyonu için hin kuşkusuz doğadan ölü zararlıları toplamak, bakteriyi buradan izole etmek gerekir. Bir diğer deyiş ile B. thuringiensis’in doğada en çok en bulunduğu yerden yani etki ederek öldürdüğü larvalardan izole edilmesi gerekir. Bu amaçla laboratuvara getirilen ölü larvalar steril damıtık su ile yıkanır, sonra yüzey sterilizasyonu için %2,5 hipoklorit içinde 1 dakika tutulur, tekrar steril su ile yıkanır ve 65 °C ‘de 20 dakika su banyosunda tutularak zararlı içindeki vejetatif hücrelerin ölmesi sağlanır. Sonra steril baget yardımı ile 1 ml kadar steril fizyolojik tuzlu su içinde eizilir ve buradan Nutrient Broth’a ekim yapılarak 32 °C ‘de 48 saat tutulur. Daha sonra Nutrient Agar üzerine sürme yapılarak tek koloniler elde edilir. Morfolojik karakter bakımından B. thuringiensis olduğu kanısına varılan kolonilerden Nutrient Broth’da tekrar üretilir ve yine Nutrient Agar’a sürülerek saflık kontrolü yapılır. Morfolojik özellikler olarak gram boyama, spor boyama ve hareketlilik testleri yapılır. Kültürel özellikler olarak Nutrient Agar’daki koloni şekilleri, Nutrient Broth’da gelişme ve NaCl (tuz) içeren Nutrient Broth’da üreme durumlarına bakılır, fizyolojik özellikler olarak oksijen istekleri, kazein, yumurta sarısı, jelatin, üre ve nişastayı hidrolize etme durumları, indol, VP testleri, şekerlerin kullanımı, nitrat redüksiyonu, katalaz, arjinin hidrolaz ve Tween esteraz reaksiyonları incelenir.

2- Etkili İzolatların Belirlenmesi

Örneğin un güvesine karşı etkili olan B. thuringiensis suşlarının etkinliği kontrol edilmek isteniyorsa kavanozlara un güvesi için besin ortamı olarak un, belirli sayıda un güvesi ve bakteriden elde edilen toz preparattan belilrli bir miktar konulur. Larvalar 15 gün süre ile izlenir, kontrol kavanozundaki ölü sayısı ile kıyaslanarak hangi şuşların etkili oluğu ortaya konulur. Etkili izolatlar yeniden aynı şekilde denenerek etkileri kontrol edilir.

3- Toz Preparat Hazırlanması

İzolatlar 150 ml Nutirent Broth besiyerinde çalkalamalı inkübatörde 72 saat süre ile 32 °C’de ve 150 devir/dakika çalkalama hızı ile tutulur. Sonra sporlandırma ortamına alınır ve burada 18 saat süre ile 32 °C’de %90 nemde bırakılır. En son olarak 55 °C’ de 48 saat süre ile kurutulur, öğütülür ve 100 mesh elekten geçirilerek toz preparat elde edilir.

Ticari Üretim

Endüstriyel boyuttaki üretimlerde özellikle besiyeri giderleri maliyeti nemli ölçüde etkiler. Bu nedenle et artıklarından pepton, nişastadan glukoz elde edilmesi gibi uygulamalarda üretim teknolojisi içinde yer alır.

Bunun dışında spoarlandırma ortamı olarak buğday kepeği, soya unu, perlit, kalsiyum klorür, tuz gibi ucuz olarak bulunan girdiler kullanılır.

Üretimde nem ve sıcaklık kontrolü yapabilen, dışarıdan steril sıcak hava verilerek kurutmanın sağlanabildiği kabinler kullanılır.

B. thuringiensis üretiminde genlede iki yöntemden yararlanılmaktadır. Bunlar yarı katı fermentasyon ve derin kültür üretimidir. Yarı katı fermentasyon yönteminde mikroorganizmaların gelişmeleri için aerobik koşullar uygulanmakta olup yeterli havalanma sağlanmaktadır. Yarı katı yüzey kültüründe mikroorganizmaların gelişmeleri için gerekli oksijen rahatlıkla temin edilebilmektedir. Besiyeri olarak 15 gr glikoz, 5 gr mısır ıslatma suyu ekstraktı, 5 gr maya ekstraktı, 4 g K2HPO4 ve 1 litre damıtık su kullanılmakta ve ph 7.0 – 7.2 arasında tutulmaktadır. Daha büyük üretimler için katı besiyeri hazırlanmakta, bunun bileşiminde ise buğday kepeği, perlit, soya unu, glikoz, kireç, tuz, kalsiyum klorür ve belirli miktar su bulunmaktadır. Sonuçta karışımın içindeki nem oranı % 60 olarak ayarlanmaktadır. Daha sonra dipten havalandırmalı özel tavalara yerleştirilmekte ve bu katı destek maddeler üzerine sıvıda yetiştirilmiş B. thuringiensis vejetatif hücreleri ileve edilmektedir.

26-08-2010, 22:23	#130
acemi_caylak Ağaç Dostu Giriş Tarihi: 29-11-2009 Şehir: İstanbul - Gaziantep Mesajlar: 1,194	Doç. Dr. A. Kadir Halkman'ın Tarım Mikrobiyolojisi kitabında, B. thuringiensis' in (forumda bilinen adıyla Delfin WG) biyoinsektisit olarak üretilmesi ayrıntılı olarak var. Buraya da aktarıyorum. Melas, buğday unu, soya unu vb. yöntemler bu konunun okuyucularına hiçte yabancı değil. Ki bir çok bakteri fermentasyon yöntemi ile üretiliyor. Önemli olan bunların bulundukları ortamları bilmek ve buradan alınan örneklerden izole edebilmek. Zararlı böceklerin kontrolünde Bacillus cinsinden bakteriler kullanılmaktadır. Bu alanda kullanılan bakterilerin sporlu olmaları dikkat çekicidir. Sporlu bakterilerin kolayca ve büyük miktarlarda üretilebilmeleri, ticari amaçla kullanılmalarının başlıca nedenidir. Buna karşın spor oluşturmayan, oysa büyük miktarlarda üretilebilen hiç bir sporsuz bakeri ticari amaçla kullanılammıştır. Bu durum, muhtemelen, sporsuz bakerilerin pratikte kolayca stabilize edilememelerinden doğmaktadır. Biyolojik İnsektisitlerin Üretimi Entomopatojenler ya fermentasyon yolu ile (in vitro) ya da yaşayan böcekler üzerinde (in vivo) üretilirler. Derin veya yüzey fermentasyon yöntemleri fakültatif entomopatojenler (bakteri ve mantarlar) için, in vivo yöntemler ise, zorunlu entomopatojenler (virüs ve protozoonlar) için uygulanır. Örneğin B. thuringiensis ve B. moritai bakterilerinin ticari üretimi için genellikle derin fermentasyon yöntemi seçilir, yüzey fermentasyonu ise B. bassiana ve Hirsutella thompsoni gibi funguslar için kullanılır. In vivo yöntemler sadece böcek virüsleri ve protozoonlar için kullanılıyorsa da bazı istisnalar da vardır. Örneğin B. popilliae bakterisinin sporlarından oluşan ve piyasada “Doom” adı ile bilinen insektisit canlı böcek larvalarından üretilebilmektedir. Yöntem ne olursa olsun, ilk olarak böcek patojeni olan mikroorganizma bol miktarda üretilir, cam şişelere dağıtılarak liyofilize (dondurarak kurutma) edilir. Üretim için daima bu referans suşlar kullanılır. Bakteriyel entomopatojenler elde edilirken bu şişelerdeki liyofize kültürden eğri besiyerlerine ekim yapılır ve bunlar başlangıç inokülümü (başlangıç kültürü, aşı) olarak kullanılır. Yüzey ve derin fermentasyon yöntemlerinde başlangıç inokülümünden önceki aşamalar aynıdır. Ancak üretim ve ürünü elde etme işlemlerinde önemli farklar vardır. Fermentasyon için çeşitli karbon (melas, glikoz, tahıl ezmesi ,tahıl ürünleri) ve azot (pamuk tohumu, balık, soya fasulyesi, maya, kazein hidrolizatı) kaynakları kullanılır. Gerekiyorsa ana mineraller ve üreme faktörleri de ilave edilir. Fermentasyon sonunda oluşan ürün santrifüjde çevirme, filtrasyon, presipitasyon (dibe çöktürme) veya püskürterek kurutma gibi işlemlerden biri veya bu işlemlerin bir kombinasyonu ile elde edilir. Fermentasyon tipine, yöntemin ekonomik oluşuna veya spesifik formülasyon gereksinimine bağlı kalınarak, uçucu sıvı, suda eriyebilen pudra, toz veya granüler ürün haline getirilir, aktivite tayini yapılarak piyasaya verilir. Entomopatojenlerin in vivo olarak üretilmesinde ilk kez tırtıl larvaları kullanılmıştır. Bugün ise tırtıl larvalarının yanısıra, güve, pamuk kurdu ve sivrisinek larvalarından yararlanılmaktadır. Larvaların üretimi için belirli loşulların sağlandığı insektoryumlar ve özel bir diyet hazırlanır. İnsektoryumlarda hastalıksız ve standart olarak elde edilen larvaların %95’i üretilecek entomopatojen virüs (veya protozoon) ile infekte (bulaştırma) edilir, kalanı ise böcek kültürünün devamlılığını sağlamak üzere muhafaza edilir. Entomopatojen tarafından öldürülen larva hücrelerinden bir emme tüpü vasıtası ile mikroorganizmalar toplanır ve ticari preparasyonlar haline getirilir. Bacillus thuringiensis B. thuringiensis’in yaygın olarak kullanıldığı yerler yonca, enginar, pamuk, fasulye, lahana, karnabahar, kereviz, salatalık, marul, kavun, patates, ıspanak, tütün, tatlı mısır gibi tarla ve bahçe bitkileri, portakal, elma, üzüm, limon, zeytin gibi meyveler ile orman ağaçları ve süs bitkilerindeki çeşitli böceklerdir. Bunların dışında bal arısı kovanlarında görülen büyük mum güvesine karşıda kullanılmaktadır. B. thuringiensis grubu bakteriler aerobik (oksijenli solunum), hareketli, çubuk şeklinde gram ve katalaz pozitif, endospor oluşturan, fermentatif, mikroaerofilik (çok düşük oksijen düzeyinde solunum yapabilen) ve anaerobik (oksijensiz) üreme yeteneğine sahiptir. Bunlar aerobik koşullarda spor meydana getirmekteir. Taksonomik olarak (canlıların sınflandırılması) Bacillus cereus ile yakından ilişkilidir. Ancak B. thuringiensis serotipleri spor oluşum aşamasında delta toksin veya parasporal kristalin bulunuşu ile karakterize edilmektedir. Bu yapı diğer hücre metaryelleri gibi boyanmakta, eksosporium oluştuğunda serbest halde görülmekte, sporlardan kolaylıkla ayrılmaktadır. B. thuringiensis’in tanıları ise parasporal kristal oluşmundan başka diğer toksinlerin üretimine, esteraz tiplerine, vegetatif hücrenin flagella antijenlerine göre yapılmaktadır. Endüstriyel Üretim 1- İzolasyon Hedef zararlıya karşı etkili entomopatojenin izolasyonu için hin kuşkusuz doğadan ölü zararlıları toplamak, bakteriyi buradan izole etmek gerekir. Bir diğer deyiş ile B. thuringiensis’in doğada en çok en bulunduğu yerden yani etki ederek öldürdüğü larvalardan izole edilmesi gerekir. Bu amaçla laboratuvara getirilen ölü larvalar steril damıtık su ile yıkanır, sonra yüzey sterilizasyonu için %2,5 hipoklorit içinde 1 dakika tutulur, tekrar steril su ile yıkanır ve 65 °C ‘de 20 dakika su banyosunda tutularak zararlı içindeki vejetatif hücrelerin ölmesi sağlanır. Sonra steril baget yardımı ile 1 ml kadar steril fizyolojik tuzlu su içinde eizilir ve buradan Nutrient Broth’a ekim yapılarak 32 °C ‘de 48 saat tutulur. Daha sonra Nutrient Agar üzerine sürme yapılarak tek koloniler elde edilir. Morfolojik karakter bakımından B. thuringiensis olduğu kanısına varılan kolonilerden Nutrient Broth’da tekrar üretilir ve yine Nutrient Agar’a sürülerek saflık kontrolü yapılır. Morfolojik özellikler olarak gram boyama, spor boyama ve hareketlilik testleri yapılır. Kültürel özellikler olarak Nutrient Agar’daki koloni şekilleri, Nutrient Broth’da gelişme ve NaCl (tuz) içeren Nutrient Broth’da üreme durumlarına bakılır, fizyolojik özellikler olarak oksijen istekleri, kazein, yumurta sarısı, jelatin, üre ve nişastayı hidrolize etme durumları, indol, VP testleri, şekerlerin kullanımı, nitrat redüksiyonu, katalaz, arjinin hidrolaz ve Tween esteraz reaksiyonları incelenir. 2- Etkili İzolatların Belirlenmesi Örneğin un güvesine karşı etkili olan B. thuringiensis suşlarının etkinliği kontrol edilmek isteniyorsa kavanozlara un güvesi için besin ortamı olarak un, belirli sayıda un güvesi ve bakteriden elde edilen toz preparattan belilrli bir miktar konulur. Larvalar 15 gün süre ile izlenir, kontrol kavanozundaki ölü sayısı ile kıyaslanarak hangi şuşların etkili oluğu ortaya konulur. Etkili izolatlar yeniden aynı şekilde denenerek etkileri kontrol edilir. 3- Toz Preparat Hazırlanması İzolatlar 150 ml Nutirent Broth besiyerinde çalkalamalı inkübatörde 72 saat süre ile 32 °C’de ve 150 devir/dakika çalkalama hızı ile tutulur. Sonra sporlandırma ortamına alınır ve burada 18 saat süre ile 32 °C’de %90 nemde bırakılır. En son olarak 55 °C’ de 48 saat süre ile kurutulur, öğütülür ve 100 mesh elekten geçirilerek toz preparat elde edilir. Ticari Üretim Endüstriyel boyuttaki üretimlerde özellikle besiyeri giderleri maliyeti nemli ölçüde etkiler. Bu nedenle et artıklarından pepton, nişastadan glukoz elde edilmesi gibi uygulamalarda üretim teknolojisi içinde yer alır. Bunun dışında spoarlandırma ortamı olarak buğday kepeği, soya unu, perlit, kalsiyum klorür, tuz gibi ucuz olarak bulunan girdiler kullanılır. Üretimde nem ve sıcaklık kontrolü yapabilen, dışarıdan steril sıcak hava verilerek kurutmanın sağlanabildiği kabinler kullanılır. B. thuringiensis üretiminde genlede iki yöntemden yararlanılmaktadır. Bunlar yarı katı fermentasyon ve derin kültür üretimidir. Yarı katı fermentasyon yönteminde mikroorganizmaların gelişmeleri için aerobik koşullar uygulanmakta olup yeterli havalanma sağlanmaktadır. Yarı katı yüzey kültüründe mikroorganizmaların gelişmeleri için gerekli oksijen rahatlıkla temin edilebilmektedir. Besiyeri olarak 15 gr glikoz, 5 gr mısır ıslatma suyu ekstraktı, 5 gr maya ekstraktı, 4 g K2HPO4 ve 1 litre damıtık su kullanılmakta ve ph 7.0 – 7.2 arasında tutulmaktadır. Daha büyük üretimler için katı besiyeri hazırlanmakta, bunun bileşiminde ise buğday kepeği, perlit, soya unu, glikoz, kireç, tuz, kalsiyum klorür ve belirli miktar su bulunmaktadır. Sonuçta karışımın içindeki nem oranı % 60 olarak ayarlanmaktadır. Daha sonra dipten havalandırmalı özel tavalara yerleştirilmekte ve bu katı destek maddeler üzerine sıvıda yetiştirilmiş B. thuringiensis vejetatif hücreleri ileve edilmektedir. Düzenleyen acemi_caylak : 27-08-2010 saat 09:19